长链非编码RNA（longnon-codingRNA，LncRNA）一般指不具有蛋白编码能力，转录本长度超过200nt的RNA分子，包括intronic/exoniclncRNAs、antisenselncRNAs、overlappinglncRNA和long intergenic ncRNAs（lincRNAs）。LncRNA与细胞周期和分化、发育、生殖、性别调控、衰老以及多种人类疾病密切相关。
lncRNA数量比较多，大约是为mRNA的3-100倍，但是目前多数lncRNA的功能仍不清楚，有很大的研究空间。最近，有文章报道lncRNA可以编码微肽并具有特定生物学功能，又拓展了新的研究方向。因此，lncRNA是目前生物和医学研究中的热点话题之一。
高通量研究lncRNA主要思路
1. 利用组学研究LncRNA时空表达模式
包括不同发育阶段、疾病发展进程等生物学连续过程中的lncRNA的种类、数量和表达丰度。
2. 候选lncRNA的功能研究
高通量筛选出对照组/处理组、处理不同时间点间以及其它生物学相关差异候选lncRNA，再进行后续功能学研究或作为疾病治疗靶点和biomarker研究。
3. LncRNA-mRNA或LncRNA-lncRNA interaction调控生物学功能研究
例如利用Genome-scale RNA interactome analysis（RIA-Seq）分析到TINCR lncRNA与多种mRNA结合调控细胞发育。
4. miRNA-dependent CeRNA研究（转录组层面）。
5. LncRNA的多组学研究（基因组、转录组、表观组学等多层面）。
6. LncRNA编码肽段的研究
高通量预测组学lncRNA数据的蛋白编码能力，生信分析流程中保留可以编码的lncRNA进行后续研究。
下面我们通过两篇基迪奥项目文章，看看别人如何研究lncRNA的表达模式。
一、LncRNA测序研究山羊骨骼肌发育
发表期刊：《BMC Genomics》
影响因子：3.867
研究背景：山羊发育过程中，有关骨骼肌lncRNA的研究很少。
研究思路：取4个不同发育时间、3个生物学重复的肌肉，进行链特异性RNA-Seq建库，生信分析lncRNA数量，表达情况。
研究结果
1. LncRNA高通量测序
通过链特异性RNA-Seq建库，对下机raw data进行过滤后，75.20–86.60% clean reads能够比对上山羊参考基因组（CHIR_1.0, NCBI）。再通过生信流程分析鉴定到3515个intergenic lncRNAs（88.29 %）和466个anti-sense lncRNAs（11.71 %）转录本，对应2739个lncRNA genes。平均长度1296 bp，含有2.4 exons。
同时检测到24,383个protein coding转录本，平均长度1978 bp，含有8.4 exons，其中只有10.6%含有2-3个exons。
2. LncRNA差异表达研究
利用Cuffdiff软件计算lncRNA转录本的表达量FPKM（fragments per kilo-base of exon per million fragments mapped），共577 lncRNA trans在发育过程中差异表达。
3. lncRNAs cis调控研究
查找protein-coding genes上下游10-kb的区域的lncRNA，发现1153 lncRNAs与1455 protein-coding gene位置临近，可能参与调控基因转录或者转录后水平。接着对共表达基因进行GO和KEGG富集分析，研究它们相关生物学功能。结果显示RBP4, PLN, MYLK2, RARA, 等基因处于muscle development-related GO term（GO:0014706），与肌肉发育密切相关。
4. lncRNAs trans调控研究
通过生信分析lncRNA trans调控的靶基因，结果显示1747 lncRNA trans与19,846 protein-coding trans有结合的关系。同样对共表达基因进行GO和KEGG富集分析，研究它们相关生物学功能和通路。
5. qPCR验证
随机挑选6个差异表达lncRNAs进行qPCR验证，qPCR结果显示与RNA-Seq的一致性。说明高通量测序和生信分析lncRNA的可靠性非常高。
二、利用大鼠模型研究阿兹海默症相关lncRNA和mRNA
发表期刊：《Mol Neurobiol》
影响因子：5.397
研究背景：阿兹海默病（AD）的发病机理没有完全研究清楚，并且lncRNA在阿兹海默病中的作用研究较少。
研究思路：构建大鼠疾病模型，对AD组（n = 10）和 control组（n = 10）进行芯片分析，生信分析差异lncRNA和mRNA。
研究结果
1. 组间差异表达lncRNA和mRNA
Case-control组间发现315个显著差异的lncRNA（238个上调，77个下调）。同时发现311个显著差异的mRNA（191个上调，120个下调）。
2. qPCR验证
qRT-PCR结果与microarray data存在一致性，lncRNAs BC092582、MRAK050857和mRNA S100A8 在AD中下调；
lncRNAs MRAK088596、MRAK081790和mRNA MAPK10 在AD大鼠中上调。
3. lncRNA调控的mRNA功能富集分析
通过生信方法分析lncRNA调控的mRNA，再进行GO和KEGG富集分析。发现这些mRNAs的功能与endocrine process（ontology: biological process, GO:0050886）， extracellular region part（ontology: cellular component, GO:0044421）和neurokinin receptor binding（ontology: molecular function, GO:0031834）相关。
4. lncRNA-mRNA共表达网络分析
利用差异lncRNA和差异mRNA构建共表达网络，共有454 network nodes和478个相互作用关系将168个差异mRNAs 和286个差异lncRNAs联系起来。1个mRNA可以结合1-66个lncRNAs，1个lncRNA可以与2个mRNA发生作用。
总结
这两篇文章（3-5分）中的LncRNA的测序分析内容并不复杂，包括：转录本统计和注释、差异表达分析、cis/trans调控分析、靶基因功能富集分析、共表达网络分析等。这表明常规的标准生信流程分析足够普通文章的发表分量。
都只有简单的qPCR对测序结果的验证，如果加入更多的基因功能研究，文章的将会再上一个层次。
第一篇文章采用了四个不同发育时间的12个样本，数量比较充足；第二篇中成功构建了特定的疾病模型，也容易找到与正常样本差异表达的基因。这说明样本的设计和选择是非常重要的，直接影响后续结果优劣。
这两篇文章都是关于lncRNA整体表达的，只是比较常见的一种思路。文章开头还例举了其它的一些思路供参考，可以根据研究目的，设计合适的方案。
参考文献：
【1】Zhan S, Yao D, Wei Z, et al. Genome-wide identification and characterization of long non-coding RNAs in developmental skeletal muscle of fetal goat[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1):666.
【2】Yang B, Xia Z A, Zhong B, et al. Distinct Hippocampal Expression Profiles of Long Non-coding RNAs in an Alzheimer's Disease Model[J]. Molecular Neurobiology, 2016:1-14.
联系客服
