lncRNA研究策略与技术

研究背景：

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
 

图1. lncRNA参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示lncRNA。 A.染色质重组 B.转录激活和抑制 C.蛋白抑制 D.转录后修饰 E.诱导分子
 

锐博生物提供研究思路：

 

 

差异lncRNA筛选的研究方法：
 

 

 
 

案例解读：
 

案例(一)RNA seq发现lincRNA
 

1.  2011年，Rinn研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了8000多个人的lincRNA

图2. A.利用RNA-seq预测lincRNA的流程图  B.多个参考数据库找到的lincRNA的数量及交集及用软件组装的结果

2.  lincRNA的表达具有组织特异性

图3. lincRNA和mRNA在不同组织当中的表达情况

案例(二)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物
 

2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。对64个肿瘤样品高通量测序，在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072新的lncRNA。
 

图4.肿瘤和对照样品lncRNA表达谱分析

案例(三)lncRNA表达谱芯片结合lncRNA-mRNA共表达网络筛选关键lncRNA
 

第二军医大学的研究人员利用2/3肝部分切除(PH)小鼠在不同的时间点，针对肝脏再生过程进行了全基因组lncRNA芯片表达谱分析。通过lncRNA和mRNA共表达网络分析找到了一个非常有意义的长链非编码RNA(lncRNA-LALR1)，并结合体内外实验证实在肝再生过程中lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-Catenin信号加速细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。因此采用药物干预靶向lncRNA-LALR1诱导肝脏再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治疗。
 

1.  表达谱芯片检测肝脏生长相关的lncRNA

图5. 表达谱芯片聚类分析小鼠肝脏2/3切除后 0，1.5，12和24小时1231个lncRNA和3141个mRNA表达谱

2.  KEGG pathway 分析与肝脏生长相关的信号通路
 

图6. Pathway 分析展示最相关的信号通路
 

3.  共表达网络分析找到关键的lncRNA-LALR1
 

图7. 部分共表达网络分析，包含22个基因，18个lncRNA(k-core=12), 4个mRNA(k-core=11 and degrees≥28)，位于中心位置的是lncRNA-LALR1

案例(四)lncRNA 功能研究

研究者对位于HOXA基因簇的5‘端启动子区域的非编码RNA HOTTIP进行了功能研究，研究证明HOTTIP可以增强HOXA的转录；对HOTTIP体内外的干扰研究发现HOTTIP在发育过程中起到重要作用，例如影响鸡远端骨的形成。
 

1.  RT-PCR和FISH结果验证lncRNA HOTTIP的表达具有组织中特异性
 

图8. A.HOTTIP在人不同组织器官中的表达情况B. E13.5小鼠胚胎上HOTTIP的原位杂交
 

2.  通过RNAi技术可以下调lncRNA HOTTIP的表达量
 

图9. A. 针对HOTTIP设计的siRNA可以下调HOTTIP基因及距离40 kb左右的编码基因HOXA13、HOXA11、HOXA10、HOXA9和HOXA7的表达量。B.对HOTTIP基因的干扰不影响HOXD基因和BID基因的表达

3.  动物实验验证HOTTIP干扰载体的表达可以影响HoxA基因的表达及骨质的形成。

图10. A. FISH结果显示HOTTIP干扰载体在鸡胚胎中的过表达影响HoxA基因的表达。B. HOTTIP基因表达量的下降导致远端骨头变短。

参考文献

1.  Wang KC, Yang YW, Liu B, et al. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression. Nature.2011; 472(7341): 120–4.

2.  Cabili MN, Trapnell C, Goff L, et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specificsubclasses. Genes Dev. 2011; 25(18): 1915–27.

3.  Cheetham SW, Gruhl F, Mattick JS, et al. Long noncoding RNAs and the genetics of cancer. Br J Cancer. 2013; 108(12): 2419-25.

4.  Brunner AL, Beck AH, Edris B, et al. Transcriptional profiling of long non–coding RNAs and novel transcribed regions across a diverse panel of archived human cancers. Genome Biol. 2012; 13(8): R75.

5.  Xu D, Yang F, Yuan JH，et al. Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/β- Catenin signaling. Hepatology. 2013; 58(2): 739–51.