试剂相同？胆红素（TB/DB）检测再认识

作者：河南省开封市儿童医院检验科  翟凯齐

总胆红素测定试剂盒

（钒酸盐氧化法）说明书

【主要组成成份】（表1）

直接胆红素测定试剂盒

（钒酸盐氧化法）说明书

【主要组成成份】（表2）

问题出在两张日常的生化试剂说明书上，见表1、2。既然检测项目有所区别，为什么两份不同项目试剂说明书中除标题外其余部分怎么会高度一致？随即联系了试剂厂家工程师，厂家回复：各厂家的试剂书中关于试剂成分的说明都有规避其核心技术的考虑，不会把所有细节阐释清楚…心中的疑问顿时没了方向。

让我们顺着两份说明书唯一差别入手，TB试剂部分R1中唯一比DB试剂多出一项表面活性剂！

问题1：是不是该项的加入导致了反应物的差别？

问题2：活性剂成分？特异性如何？

线索一：胆红素构成

血清中胆红素有三种存在形式：未结合胆红素、结合胆红素和共价结合与白蛋白的胆红素。这三种形式的胆红素在水溶液中具有不同的溶解度，因而对重氮试剂的反应能力也有差别。未结合胆红素在水溶液中的溶解度极低，而另外两种溶解度较好。由于这几种胆红素溶解度的特性，影响着人们如何选择测定这些胆红素的方法^[1]。

线索二：常见检测方法

线索三：钒酸盐氧化法

钒酸盐氧化法由日本学者Tokuda于1993年建立^[2]，检测原理即以钒酸为氧化剂测定胆红素的方法。以阳离子表面活性剂溴化铵(CTAB)作为反应促进剂（R1），以羟胺作为柠檬酸盐或酒石酸盐缓冲液的反应抑制剂（R1），从而分别测定总胆红素和直接胆红素的浓度。采用含乙二胺四乙酸(EDTA)或羟乙磷酸的钒酸(4 mmol/L)溶液作为(R2)。用两点法测定氧化反应前后特定波长的吸光度，计算胆红素浓度。

小结&讨论

问题阐释到这里，其实“试剂说明书”之谜宣告破解，在TB检测R1部分，溴化十六烷基三甲铵不仅充当了表面活性剂的成分，在反应体系中对于整个实验起到了至关重要的促进作用，使得血清中胆红素各组分均参与了钒酸盐氧化反应，通过监测反应前后吸光度的变化，进而计算出TB的含量；反之，基本雷同的试剂构成中，因为加入了硫酸羟胺溶液这一强还原剂，进而对于除DB外胆红素部分进行了封闭和抑制，进而检测出DB单一成分的含量。两个项目，实验原理一致，差别仅在于利用所检测成分物理特性的差异而进行特异性选择，一正一反选择的差别，使得看上去几乎一样的实验有了选择性。不仅由衷赞叹该项目实验设计之巧妙，也不由得感慨医学实验室检测手段的更新与基础化学、物理研究联系之紧密！

【参考文献】

[1] 叶应妩等.主编全国临床检验操作规程第三版[M]．南京：东南大学出版杜，2006

[2] Tokuda K，Tanimotok．A new method of measuring bilirubin in serum by Vanadic acid[J]．Jpn J Clin Chem (in Japanes with English abstract)，1993，22：116-122．

编辑：Rose  审校：赵三好