之前我们已经介绍了三种双特异抗体高通量筛选方法，今天我们继续介绍另外一种方法——转肽酶介导的DARPins（设计的锚蛋白重复序列：designed ankyrin repeatproteins）。与其说其为双抗，不如说其为双功能蛋白，因为DARPins本质上并不是抗体，而是经过设计，能够结合特异性靶点的蛋白。
关于DARPins
DARPins是人体基因组表达最丰富的结合蛋白之一，与其它重复蛋白类似，其含有由不同数目重复序列构成重复蛋白结构域，其主要功能是与靶蛋白结合，从而导致不同作用模式，如酶抑制剂，蛋白之间的锚定等。DARPins的结构如下图所示，其除了含有重复序列结构域外，还有N端的帽子和C端的帽子，主要用来稳定重复序列结构域。其中间的重复序列结构域的数量可以变化，一般为4-6个，因此其分子量大小为14-21KDa。目前已经有研究者开发出核糖体展示库筛选对目的抗原结合的DARPins。
图1：DARPins结构示意图
高通量双靶点DARPins筛选设计
双靶点DARPins顾名思义包含两个DARPins，靶向两个不同的靶点。其中位于N端的DARPins末端含有G4S连接子和LPETG短肽序列，该序列主要是转肽酶A识别的氨基酸序列，最后为His标签，用于N段DARPins的纯化；位于C端的DARPins，其N末端包含Hisb标签，用于纯化，接下来是TEV序列，该序列是TEV酶识别的序列，在TEV酶的作用下，His标签被切割，同时暴露GGGGG序列，该序列主要是在转肽酶A的作用下可N端DARPins进行连接。连接完成后的双靶点DARPins结构示意图如图２A所示，两端为识别不同靶点的DARPins，中间为G4S＋LPET＋G5的连接子。这样，不同靶点的DARPins在转肽酶A的作用下就可以形成双靶点的DARPins。其产物可以在不纯化的情况下进行高通量检测（图2B）
图2；双靶点DARPins的形成及高通量检测
在双靶点DARPins的形成过程中，最关键的是转肽酶A。 转肽酶A最初在金黄色葡萄球菌中发现，其作用之一是将细菌表面的蛋白固定到细菌的细胞壁上。其反应过程如图3所示，首先，LPETG序列被转肽酶A识别，然后转肽酶作用下LPETG序列中的甘氨酸（G）与苏氨酸（T）的肽键被切割，并形成酰基酶中间体，然后该中间体被亲核的甘氨酸基团攻击并发生反应，最后转肽酶脱落，LPET的苏氨酸与新的甘氨酸形成肽键。
图3：转肽酶A介导的反应机制
双靶点DARPins的高通量筛选
研究者筛选了针对不同抗原（EpCAM,EGFR,ErbB2,ErbB3,ErbB4,c-MET）的21个DARPins分子，利用转肽酶A连接后，利用反应体系的混合物进行高通量筛选。在不同肿瘤细胞中（BT474和SKBR3），双靶点DARPins对肿瘤细胞生长的抑制具有一致性，在BT474中抑制性较强的候选分子，在SKBR3中抑制性也较强（图4）。同时，该高通量筛选方法可以筛选一些具有激活性的分子，如图4中的红色所对应的分子，因此该方法也可以用于某些激动型分子的筛选。
图4：双靶点DARPins在不同肿瘤细胞中的高通量筛选
总结
DARPins是有特异性结合能力的蛋白，虽然其不是抗体，但是其具有抗体的特异性结合能力。而且DARPins还具有抗体不具备的特性，如分子量较小，因此渗透性较高；DARPins高度稳定，没有翻译后的复杂修饰；可以在大肠杆菌中表达，因此生产成本更低。
本文利用转肽酶A将两个靶向不同抗原的DARPins进行连接，形成类似于双特异性抗体的双靶点DARPins，其与前文介绍的其它双特异性抗体高通量筛选方法相比，更加高效快捷。其仅需要筛选靶向不同的抗原的DARPins，并在表达中加上相应的标签和酶识别序列，纯化后在酶的作用下进行连接形成双靶点DARPins。最重要的是，连接产物无需纯化即可进行功能筛选，而且该方法可以与液体工作站等连接，建立自动化高通量筛选。
参考文献：
1、Fabio Andres, Martin Schwill, Ykelien L. Boersma, and Andreas Pl€uckthun.High-Throughput Generation of Bispecific Binding Proteinsby Sortase A–Mediated Coupling for Direct Functional Screening in Cell Culture.AACR 2019
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