之前我们已经介绍了三种双特异抗体高通量筛选方法,今天我们继续介绍另外一种方法——转肽酶介导的DARPins(设计的锚蛋白重复序列:designed ankyrin repeatproteins)。与其说其为双抗,不如说其为双功能蛋白,因为DARPins本质上并不是抗体,而是经过设计,能够结合特异性靶点的蛋白。
关于DARPins
DARPins是人体基因组表达最丰富的结合蛋白之一,与其它重复蛋白类似,其含有由不同数目重复序列构成重复蛋白结构域,其主要功能是与靶蛋白结合,从而导致不同作用模式,如酶抑制剂,蛋白之间的锚定等。DARPins的结构如下图所示,其除了含有重复序列结构域外,还有N端的帽子和C端的帽子,主要用来稳定重复序列结构域。其中间的重复序列结构域的数量可以变化,一般为4-6个,因此其分子量大小为14-21KDa。目前已经有研究者开发出核糖体展示库筛选对目的抗原结合的DARPins。
图1:DARPins结构示意图
高通量双靶点DARPins筛选设计
双靶点DARPins顾名思义包含两个DARPins,靶向两个不同的靶点。其中位于N端的DARPins末端含有G4S连接子和LPETG短肽序列,该序列主要是转肽酶A识别的氨基酸序列,最后为His标签,用于N段DARPins的纯化;位于C端的DARPins,其N末端包含Hisb标签,用于纯化,接下来是TEV序列,该序列是TEV酶识别的序列,在TEV酶的作用下,His标签被切割,同时暴露GGGGG序列,该序列主要是在转肽酶A的作用下可N端DARPins进行连接。连接完成后的双靶点DARPins结构示意图如图2A所示,两端为识别不同靶点的DARPins,中间为G4S+LPET+G5的连接子。这样,不同靶点的DARPins在转肽酶A的作用下就可以形成双靶点的DARPins。其产物可以在不纯化的情况下进行高通量检测(图2B)
图2;双靶点DARPins的形成及高通量检测
在双靶点DARPins的形成过程中,最关键的是转肽酶A。 转肽酶A最初在金黄色葡萄球菌中发现,其作用之一是将细菌表面的蛋白固定到细菌的细胞壁上。其反应过程如图3所示,首先,LPETG序列被转肽酶A识别,然后转肽酶作用下LPETG序列中的甘氨酸(G)与苏氨酸(T)的肽键被切割,并形成酰基酶中间体,然后该中间体被亲核的甘氨酸基团攻击并发生反应,最后转肽酶脱落,LPET的苏氨酸与新的甘氨酸形成肽键。
图3:转肽酶A介导的反应机制
双靶点DARPins的高通量筛选
研究者筛选了针对不同抗原(EpCAM,EGFR,ErbB2,ErbB3,ErbB4,c-MET)的21个DARPins分子,利用转肽酶A连接后,利用反应体系的混合物进行高通量筛选。在不同肿瘤细胞中(BT474和SKBR3),双靶点DARPins对肿瘤细胞生长的抑制具有一致性,在BT474中抑制性较强的候选分子,在SKBR3中抑制性也较强(图4)。同时,该高通量筛选方法可以筛选一些具有激活性的分子,如图4中的红色所对应的分子,因此该方法也可以用于某些激动型分子的筛选。
图4:双靶点DARPins在不同肿瘤细胞中的高通量筛选
总结
DARPins是有特异性结合能力的蛋白,虽然其不是抗体,但是其具有抗体的特异性结合能力。而且DARPins还具有抗体不具备的特性,如分子量较小,因此渗透性较高;DARPins高度稳定,没有翻译后的复杂修饰;可以在大肠杆菌中表达,因此生产成本更低。
本文利用转肽酶A将两个靶向不同抗原的DARPins进行连接,形成类似于双特异性抗体的双靶点DARPins,其与前文介绍的其它双特异性抗体高通量筛选方法相比,更加高效快捷。其仅需要筛选靶向不同的抗原的DARPins,并在表达中加上相应的标签和酶识别序列,纯化后在酶的作用下进行连接形成双靶点DARPins。最重要的是,连接产物无需纯化即可进行功能筛选,而且该方法可以与液体工作站等连接,建立自动化高通量筛选。
参考文献:
1、Fabio Andres, Martin Schwill, Ykelien L. Boersma, and Andreas Pl€uckthun.High-Throughput Generation of Bispecific Binding Proteinsby Sortase A–Mediated Coupling for Direct Functional Screening in Cell Culture.AACR 2019
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