JACS：新型近红外光激活的一氧化氮供体分子应用于光声成像

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光声（PA）断层成像是一种非侵入性生物成像技术，结合了近红外（NIR）组织穿透性强和超声波检测分辨率高的优点，能实现在生物组织中深处10厘米的高分辨率成像。传统光学成像技术（如荧光成像）由于发射光的散射，在组织较大深度处分辨率较差。因此，PA成像成为极具发展前景的一种活体动物成像技术。研究人员目前已经开发了一些小分子激活的PA传感器，用于金属离子、缺氧等检测，但PA成像用于体内生物活性物质（如NO）的光化学递送检测仍是一个亟待研究的领域，具有巨大发展潜力。NO是内源性气体递质，对血管张力和神经元信号传导很重要，在炎症、再灌注损伤和癌症等疾病中也起着关键生物调节作用。

近日，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的 Jefferson Chan课题组合成了一种基于NIR光激活的NO供体分子（photoNOD-1和photoNOD-2），该分子能以NO为介质实现活体内的PA断层成像、监测NO释放动态变化及生理活动过程。该成果以“Near-Infrared Photoactivatable Nitric Oxide Donors with Integrated Photoacoustic Monitoring”为题发表于J. Am. Chem. Soc.（DOI: 10.1021/jacs.8b05514）。

作者选择在NIR波长区有较大消光系数（>10⁴ M^-1·cm^-1）的氮杂-BODIPY染料为骨架（可以提供足够的能量来介导产生N-亚硝基键，还有助于在激发时产生强PA信号，且光物理性质受化学取代影响而变化，是比率型探针的理想骨架），采用光不稳定的烷基化N-亚硝基部分作为NO供体基团，合成了photoNOD-1及其水溶性同源物photoNOD-2（统称为photoNOD），其在激光照射时释放出NO和含游离芳胺的氮杂-BODIPY（rNOD-1或rNOD-2）（Scheme 1）。缺电子的N-亚硝基键转化为富电子的N-H键，导致吸光度最大值红移。两个波长的光照射将产生两个相应的PA信号，从而能够同时识别photoNOD和rNOD，产生比率信号。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者首先对photoNOD的体外性质进行了表征：因为PA信号与摩尔吸光系数相关，所以分子的相对PA强度近似于其在任意给定波长下的吸收光谱。结果显示，photoNOD在680 nm（λ_blue）附近显示出最大吸收，而rNOD的最大吸收峰红移到730 nm（λ_red）处（Figure 1a, b），两者的最大吸收波长均位于商业PA断层摄影仪的检测波长范围内（通常为680-950 nm）。然后作者将每种化合物的溶液置于组织模拟体（深度~1 cm）内，评估NIR照射穿透组织并激活产生rNOD的能力。结果表明其能够成功地发生PA成像，照射5分钟后，rNODs的信号形成明显；30-40分钟照射后PA成像信号达到最强（Figure 1 c-e）。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

紧接着，作者对photoNOD进行了化学稳定性评估。结果显示氧化还原活性金属、还原型谷胱甘肽酶和CYP450酶等物质对于photoNOD的转亚硝化、脱亚硝基化或脱氮没有影响，不影响PA比率信号的产生。photoNOD-1和photoNOD-2的溶液经λ_blue光照射5分钟后分别产生了46.6倍和21.5倍的PA比率信号（Figure 3）。这些结果说明了photoNOD对包括氧化还原活性金属和CYP450酶在内的各种生物刺激表现出化学稳定性以及信号的高灵敏性。细胞毒性实验结果显示，共孵育后photoNOD和rNOD能够维持大于95%的细胞活力，生物相容性良好，实验条件下无细胞毒性。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

确认了稳定性和细胞兼容性后，作者开始表征活体动物体内的photoNOD和rNOD：分别将每种化合物皮下注射到BALB/c小鼠的腹腔中，实验结果确定了体内入射/激发的最佳波长λ_PAblue和λ_Pared（photoNOD-1和rNOD-1为700和830 nm；photoNOD-2和rNOD-2为710和810 nm）。photoNOD-1和photoNOD-2在照射后分别在体内产生1.37倍和2.29倍的比率信号（理论最大值为2.09倍和2.60倍），没有照射的情况分别为1.12倍和1.27倍（Figure 4）。这些数据表明photoNODs被激光照射后能够在体内介导释放NO，可被应用于监测小动物模型中NO生物学调节过程。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

先前研究表明NO在高浓度下能够控制肿瘤生长，且可以使缺氧性的肿瘤对化学疗法和放射疗法更加敏感。PA成像结果表明，在分布和组织积累方面，photoNOD-1优于photoNOD-2，但photoNOD-2在局部给药后呈现出更好的PA成像特性。因此，接下来作者围绕photoNOD-1对肿瘤的影响展开了研究。实验一周后，对照组（不用photoNOD-1处理以及用photoNOD-1处理但无光照）小鼠肿瘤的平均肿瘤体积约为90 mm³，实验组（用photoNOD-1处理且光照）小鼠肿瘤的平均体积仅为42 mm³，肿瘤体积差异大于50％（Figure 5）。这表明通过激光激活photoNOD-1释放的NO诱导的细胞毒性能够抑制肿瘤生长。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

此外，photoNOD-1处理的实验组小鼠在实验期间的行为和体重没有显著变化。与对照组相比，实验小鼠的心肝脾肺肾和肿瘤组织中观察到λ_PAblue处的PA信号具有明显增加的趋势（Figure 6），这表明各个组织脏器都可以对photoNOD-1进行有利摄取，且NO的释放仅限于照射区域。通过局部照射，photoNOD-1释放的NO可以选择性地靶向不同器官，从而在空间上实现控制NO的靶向递送。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总之，本文作者以氮杂-BODIPY为骨架合成了一种能用于PA成像的NO供体（photoNOD）。在单光子NIR照射后，photoNOD-1和photoNOD-2释放NO以及rNOD-1或rNOD-2，并且能够产生比率信号，对活体动物组织中的NO释放进行无创监测。与现有的基于荧光的photoNORM相比，photoNOD的PA成像具有无创性和高分辨率的优点，且不需要额外造影剂，能应用于更深层组织的准确成像。这种设计策略可以推广到其他小分子分析物中，扩大NIR光致分离和PA成像联合方法的应用范围，具有广阔的开发前景。

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