自组装（self-assembly）是将基本分子单元组成功能性纳米结构的一种有力工具，在光学传感和控制药物递送等方面发挥着重要作用。分子自组装主要由各种弱且可逆的非共价相互作用力驱动，包括静电相互作用（electrostatic interactions）、π-π堆积作用（π-π stacking）、范德华力（Van der Waals interactions）以及疏水效应（hydrophobic effects）。然而，复杂多变的细胞内环境经常破坏自组装纳米结构的稳定性。因此，如何在活体中构建可逆自组装系统仍是一个巨大的挑战。
近日，南开大学化学学院刘定斌研究员课题组设计合成了一种以疏水性金纳米颗粒（AuNP）为核心、pH响应型染料掺杂的共聚物为外壳的可逆自组装系统，通过调节共聚物和AuNP的分子间作用力来精确控制可逆装配-拆卸过程。相关成果以“Reversible Self-Assembly of Nanoprobes in Live Cells for Dynamic Intracellular pH Imaging”为题发表于ACS Nano（DOI: 10.1021/acsnano.8b07054）。
首先，作者通过原子转移自由基聚合（ATRP）反应合成了一系列pH响应型嵌段共聚物。这些共聚物由亲水性聚乙二醇（PEG）链和带有叔胺（二戊胺（DPA），二异丙胺（DiPA）和环六亚甲基亚胺（HA））的疏水性嵌段组成，并缀合pH不敏感的Cy5染料作为成像信标。随后，作者使用十二烷硫醇覆盖AuNP，使NP核疏水，从而引发共聚物自组装到AuNP上（图1a）。UV-vis光谱分析结果显示，AuNP的特征吸收带从525 nm红移至535 nm，且在600 nm左右出现Cy5的吸收带。AuNP具有高的荧光淬灭效率，当Cy5非常接近AuNP表面时，其表面荧光被有效淬灭（图1b）。透射电子显微镜（TEM）图像清晰地显示出纳米组件的核-壳结构，其中围绕AuNP核的有机层厚度约为3 nm（图1c）。接着，作者考察了该纳米组件的拆卸行为。作者将溶液调节为酸性时，发现Cy5的荧光强度显著增加，这说明共聚物已从AuNP中释放出来。产生该现象的主要原因是：酸性条件下，DiPA基团带正电荷，减弱了其与十二烷硫醇覆盖的AuNP核心的疏水作用。作者进一步用DPA和HA分别与四甲基罗丹明（TMR）和Cy7.5染料缀合，同样证明了pH依赖型的纳米组件的装配和拆卸过程。令人惊喜的是，三种纳米组件在不同pH值下均显示出明显的荧光跃迁（图1e）。为了定量评估pH响应性质，作者通过比率（F-Fmin）/（Fmax-Fmin）将荧光强度归一化，其中F是在期望pH值下的荧光强度，而Fmax和Fmin是完全恢复荧光和荧光淬火状态的荧光强度。极小的ΔpH10-90％值（标准化荧光强度的pH范围从10％到90％变化）充分证明了纳米组件对pH变化的高度敏感性（图1f）。
（来源：ACS Nano）
接着，作者进行了纳米组件装配-拆卸过程的分子动力学模拟研究。为了降低计算成本，作者将共聚物的分子结构简化为三个DiPA共轭PEG的重复单元。模拟结果显示，当pH>6.2时，共聚物吸附在AuNP表面，DiPA链段锚定在十二烷硫醇部分中；当pH<6.2时，共聚物从AuNP上拆卸，这与实验结果相一致（图2a）。随后，作者通过计算单个DiPA和AuNP表面之间的自由能探究了两者的相互作用力（图2b），并发现非质子化的DiPA（pH>6.2）比质子化的DiPA（pH<6.2）更易结合在AuNP表面，这表明非质子化的DiPA和AuNP之间具有更强的相互作用力。两个DiPA之间相互作用的自由能曲线表明两个质子化的DiPA之间存在明显的排斥作用（图2d），且明显强于DiPA和AuNP间的吸引力（图2c）。因此，pH引发的拆卸归因于质子化DiPA链段和疏水性AuNP表面的弱相互作用，以及酸性条件下质子化DiPA之间的强排斥作用。更进一步，作者用Gaussian 09程序计算了不同状态下DiPA的静电势（ESP），结果与自由能的计算结果高度一致（图2e）。
（来源：ACS Nano）
基于叔胺（TA）基团可逆电离的性质，作者通过改变溶液的pH值可逆地控制装配-拆卸过程。在pH为6.0-7.4的条件下，纳米组件的荧光分别恢复和淬灭三次（图3a和3b），这表明其装配-拆卸过程的可逆性。接着，作者探究了蛋白质是否影响其重组过程。结果表明，蛋白质在很大程度上影响共聚物重组成纳米颗粒的过程（图3c），但并不影响基于AuNP的共聚物的重组（图3d）。可喜的是，共聚物与AuNP和模型蛋白BSA的结合自由能计算结果也与实验结果相一致（图3e和3f）。以上结果表明，共聚物与AuNP具有更高的亲和力。
（来源：ACS Nano）
基于良好的体外实验结果，作者将纳米组件运用于监测不同细胞器的pH变化。首先用PEG-b-(PDiPA-r-Cy5)修饰的AuNP和PEG-b-(PDPA-r-TMR)修饰的AuNP分别与具有靶向作用的RGD形成的共聚物组装形成探针pHt 6.2和pHt 4.4。作者将这两种探针与HepG2细胞一起孵育，并通过共聚焦显微镜记录成像结果。探针进入细胞后被激活，4小时内，Cy5和TMR通道的荧光信号逐渐恢复，而孵育5-7小时后，荧光信号逐渐减弱（图4）。作者推测，可逆的pH响应型荧光激活-淬灭可能是由聚合物可逆组装至AuNP核心造成的，这一推测可通过细胞切片的TEM成像得到验证。作者进一步发现，纳米探针在细胞内主要历经胞吞-胞吐循环。在细胞内，纳米探针首先遇到酸性初级内体（pH=6.0-6.5），接着转运至次级内体/溶酶体（pH=4.0-5.5），最后运输到高尔基体等细胞器（pH=7.4）。
（来源：ACS Nano）
最后，作者研究了探针在细胞内从初级内体到次级内体/溶酶体的转运过程。作者用绿色荧光蛋白（GFP）融合的Rab5a和Lamp1生物标记物转染HepG2细胞，相应的生物标志物可分别特异性地识别初级内体和次级内体/溶酶体。随后，作者将GFP染色的细胞与探针共同孵育，并通过共聚焦成像进行探针与特定细胞器的共定位分析。分析结果表明，探针pHt 6.2在4小时内仍停留在初级内体，而其它探针逐渐在次级内体/溶酶体中进一步活化（图5a）。探针pHt 6.2在6小时后从初级内体完全转移至次级内体/溶酶体，而其它探针已转移到高尔基体等细胞器。相反，探针pHt 4.4于2小时内在初级内体和次级内体/溶酶体中均保持“沉默”，孵育4小时后，探针pHt 4.4的荧光逐渐恢复。这些结果表明，尽管两种pH探针可以进入相同的区室，但它们的荧光激活行为是不同的。基于上述研究结果，作者提出两种探针在不同细胞器内的动态拆卸-重组过程。进入细胞后，探针pHt 6.2中的pH响应型聚合物可以快速释放到初级内体中，当探针进入次级内体/溶酶体时，分解过程达到饱和。相反，探针pHt 4.4的分解过程仅在次级内体/溶酶体中发生。当探针转移到高尔基体等细胞器时，释放的聚合物重新组装到AuNP表面上，再次发生荧光淬灭（图5c）。
（来源：ACS Nano）
总而言之，作者设计合成了一系列pH响应型共聚物，该类共聚物在水溶液中能可逆地组装至AuNP核心上以构建纳米组件。装配和拆卸过程由TA基团的可逆质子化引发，并通过调节共聚物和AuNP核之间的相互作用力得以实现。该纳米组件有如下优点：1. 可在生理条件下进行可逆装配-拆卸；2. AuNP作为自组装模板的同时还是良好的荧光淬灭剂；3. AuNP上极少的共聚物仍可以用于生物成像；4. 纳米组件对pH具有高度敏感性；5. 纳米组件的pHt值可调节。这些pH响应型纳米组件的发现将有助于跟踪活细胞中纳米颗粒的运输过程，并可应用于生物和生物医学领域。
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