大脑功能研究是现代科学的一大难题，其中测量和监控神经递质的摄入、储存和释放至关重要。由于神经递质涉及记忆、注意力、学习、情感、睡眠和行动等诸多功能，且很多疾病都会出现神经递质异常，因此检测神经递质成为了脑科学领域的一个重要部分。目前的检测方法包括荧光成像法、毛细管电泳法和微电化学法，其中荧光成像具有侵入性更小、空间分辨率更好等特点，因此在神经递质检测中更有应用前景，但是开发具有高选择性和亲和力的荧光探针仍然是阻碍其发展的挑战。近日，美国密苏里大学Timothy E. Glass教授和Kevin D. Gillis教授合作开发了一种基于喹诺酮的新型荧光传感器，其可以高效结合儿茶酚胺同时避免荧光淬灭，并且可以用于监控去甲肾上腺素的外排。相关研究成果发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201810919），题目为：A High Affinity Fluorescent Catecholamine Sensor: Application to Monitoring Norepinephrine Exocytosis。
作者前期开发出两种类似的基于香豆素的荧光传感器（1和NS521），传感器1具有儿茶酚胺选择性，其硼酸基团可以结合邻苯二酚，同时醛基可以与氨基发生反应从而成环。这种传感器可以高亲和力选择性地结合儿茶酚胺，但是由于邻苯二酚富含电子，导致荧光显著淬灭。随后，作者开发出了另一个衍生物NS521，这个传感器对儿茶酚胺的选择性较低，但是其被甲氧基苯基取代以及没有硼酸，所以荧光增强。基于此，作者开发出了核心为喹诺酮的新一代神经传感器510（NS510），其可以通过四步反应得到，性能显著优于核心为香豆素的前两个传感器（图1）。
图1 NS510、NS521、1的化学结构和NS510的合成路线
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
作者通过紫外可见吸收光谱法和荧光光谱法研究了NS510与一系列物质的相互作用（图2）。NS510与去甲肾上腺素结合之后吸收带会发生红移。NS510和去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的亲和力都较高，但是和后二者结合之后荧光会有轻微的淬灭，和去甲肾上腺素结合则会使荧光增强接近一倍，因此可以区分去甲肾上腺素和多巴胺（目前已知的第一个具有此功能的传感器）。同时，其与糖类、氨基酸等的亲和力则较弱。与之前开发的NS521相比，NS510与去甲肾上腺素结合后的量子产量显著提高，结合前后分别为0.025和0.031，这意味着在结合状态下可以实现荧光的开启，同时荧光强度较强。和NS521相比，这个基于喹诺酮的荧光传感器可以特异性结合去甲肾上腺素并实现荧光开启，因此适合用于去甲肾上腺素的监控。
图2 NS510与各种物质的结合常数以及结合前后荧光强度比值（左）、NS510与去甲肾上腺素结合前后的紫外可见吸收光谱（右上）和荧光光谱（右下）
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
接下来，作者使用牛肾上腺嗜铬细胞作为模型测试了NS510监控去甲肾上腺素的效果（图3）。肾上腺嗜铬细胞可以在酸性囊泡中存储去甲肾上腺素和肾上腺素，并通过外泌的形式释放它们。作者通过Percoll梯度离心法获得了富含去甲肾上腺素的细胞，并将NS510加入培养基中共培养，45分钟后共聚焦成像。实验结果显示NS510可以点亮这些细胞，其胞内呈现出点状的荧光分布，这表明NS510标记了囊泡。接下来，作者使用全内反射荧光显微镜（TIRF）对标记的细胞进行了成像，这种方法可以选择性地对细胞底部进行成像，因此可以观察到粘附在细胞底表面的含有去甲肾上腺素的囊泡，同时避免其他部位荧光的影响。结果表明，荧光点和颗粒共存，一旦细胞利用外泌把囊泡外排，荧光就会消失。作者进一步使用测电流的微电极进行了分析，由于释放的儿茶酚胺会被电极快速氧化，因此附近的细胞表面电流会出现瞬时峰值。结合这两种手段，作者发现荧光囊泡的消失与细胞表面电流的峰值神同步。这表明去染色的事件就是外排事件，这也就确认了NS510可以用于监控活细胞的外排过程。
图3 NS510成功染色肾上腺嗜铬细胞中富含去甲肾上腺素的囊泡（左）、细胞外排去甲肾上腺素导致的荧光强度与表面电流同步变化（右）
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
总结：本研究开发出了一种基于喹诺酮的荧光传感器，其对儿茶酚胺具有较高的亲和力，同时可以用于实时观察活细胞内的去甲肾上腺素。其荧光强度比相应的香豆素衍生物更强，且不会出现结合导致的淬灭现象。同时，该传感器对儿茶酚胺的亲和力和选择性显著高于其他胺类物质，可以实时观察细胞释放去甲肾上腺素的过程。总之，NS510新型荧光传感器是目前已知的可以用于活细胞动态成像的选择性最高、亲和力最高的儿茶酚胺传感器。
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