Ca2+是生命体进行生理活动必不可少的重要金属离子，其浓度和分布对于维持细胞膜两侧的生物电位、正常的神经传导功能、正常的肌肉伸缩与舒张功能以及一些激素的调节作用是至关重要的。而作为细胞内重要的钙库，线粒体的钙含量比细胞质中的钙含量高出近千倍，并且具有十分完善的Ca2+摄取和释放系统。加之线粒体是细胞能量代谢的中心，其内的Ca2+参与许多疾病的病理过程，如缺血性脑损伤、老年痴呆、帕金森综合症、Ⅱ型糖尿病、癫痫等，因此在亚细胞水平测定线粒体内Ca2+的浓度和分布情况，不仅可以帮助我们更好地理解机体内Ca2+信号的转导，还可以帮助科研工作者系统地认识Ca2+在生理、病理过程中发挥的作用。
图1. 钙离子探针的合成路径
（图片来源：Angew.Chem. Int. Ed.）
近日，意大利帕多瓦大学Diana Pendin博士和Andrea Mattarei博士联手报道了一种可以定位于线粒体的荧光探针，该探针在结合钙离子前后其紫外吸收、荧光激发及发射图谱都会发生明显的变化，基于这种特性，作者将其作为钙离子探针对活细胞线粒体内钙离子的分布进行了成像。该成果以“A Synthetic Fluorescent Mitochondria-Targeted Sensor for Ratiometric Imaging of Calcium in Live Cells”为题发表于《德国应用化学》（DOI: 10.1002/anie.201902272）。
钙离子探针的合成总体上分为四步：钙离子识别母体合成-荧光团的修饰-定位基团的修饰-细胞穿透辅助基团AM的修饰。首先作者以对苯二酚为原料通过10步反应制备了含钙离子螯合结构BAPTA的衍生物A10，该衍生物在BAPTA的基础上引入了4-氯丁基以便与三苯基膦反应；之后，通过三步反应在A10的结构上引入了荧光团并在荧光团的末端接上了供定位基团反应的烷基氯。接着，通过卤素与三苯基膦的反应作者得到了含有两个三苯基膦的探针中间体A15；最后，经过水解和加成作者得到了含有AM基团的探针mt-fura-2-AM。
图2. mt-fura-2-AM的定位及其对钙离子的荧光成像
（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
由于该探针中含有能结合钙离子的结构，因此作者首先通过紫外和荧光研究了其光谱性质的变化，结果表明该探针在结合钙离子前后，其最大吸收波长和发射波长分别从385 nm和540 nm蓝移到了345nm和520 nm，而其最大激发波长从350 nm红移到了400 nm。此外，与线粒体荧光蛋白的共定位实验表明所合成的探针确实能够如预期的一样在进入到细胞后富集到线粒体中。基于这些实验结果，作者研究了该探针在细胞内对钙离子浓度变化的响应。结果表明，350 nm激发下其荧光信号在结合了钙离子后出现了轻微的增强，而400 nm激发光下其荧光信号则出现了明显的降低，而两者的比例在结合前后的变化则高达300%。值得注意的是，与之前报道了基于罗丹明的线粒体钙离子探针相比，新制备的mt-fura-2-AM具有更高的光稳定性，并且不会轻易地从线粒体中泄露出来。
最后，作者利用探针对Hela细胞内钙离子流进行了实时的分析，并且成功观测到了KCl刺激下心肌细胞内钙离子的增长。
全文作者：Diana Pendin, Rosa Norante, Andrea De Nadai, Gaia Gherardi, Nicola Vajente, Emy Basso, Nina Kaludercic, Cristina Mammucari, Cristina Paradisi, Tullio Pozzan and Andrea Mattarei。
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