【生化】Chem. Sci.：内质网靶向荧光探针用于锌离子成像

内质网（ER）是由一层单位膜所形成的囊状、泡状和管状结构，能形成一个连续的网膜系统，发挥着蛋白质合成和运输、蛋白质折叠、碳水化合物代谢等作用。然而，未折叠或者错误折叠的蛋白质合成并积聚在内质网会引起内质网应激并导致炎症、糖尿病和神经退行性疾病的发生。除此之外，内质网还充当着生物介质（包括锌）在细胞中的存储场所。大量报道表明锌转运蛋白的消耗以及锌缺乏会引起ER应激并激活未折叠蛋白反应（UPR）。因此，研究新型分子用于亚细胞区域的锌离子（Zn²⁺）成像显得尤为重要。

 

近日，英国基尔大学的Michael Watkinson教授课题组设计合成了一种以环己基磺酰脲作为不同Zn²⁺受体的ER靶向基团，用于检测衣霉素或毒胡萝卜素诱导的内质网应激下移动的Zn²⁺变化的荧光探针。该探针具有对Zn²⁺良好的荧光转换、高选择性、低毒性，有助于研究者们更好地理解细胞中内质网对锌稳态失衡的反应机制，以及锌稳态在疾病发生和发展中的作用。相关成果以“Endoplasmic reticulum targeting fluorescent probes to image mobile Zn²⁺”为题发表在Chemical Science上（DOI: 10.1039/c9sc04300d）。

 

为了合成目标探针，作者以4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺为原料，根据文献方法合成ER靶向基团6，随后其与荧光团4-溴1,8-萘酐进行一系列反应得到叠氮化物7。叠氮化物7与炔烃8或者10进行简单高效的点击反应后生成化合物9和11，11经TFA脱保护后得到化合物12（Scheme 1）。以上化合物均经过¹H、¹³C和IR光谱以及高分辨质谱的表征。

（来源：Chemical Science）

 

随后，作者研究了目标探针9和12在溶液中的光物理性质，用Zn²⁺对其进行荧光滴定实验，发现两个探针对Zn²⁺均呈“开“响应。随着Zn²⁺当量的增加，探针9和12的荧光逐渐增强，分别增加约16倍和4倍（Figure 2a）。用强Zn²⁺螯合剂TPEN处理后，化合物9的荧光完全淬灭而12的部分被淬灭。随后作者测试了两个探针的pH依赖性荧光响应，结果表明探针在生理学相关的pH范围（3.0-10.0）内对Zn²⁺均有良好的荧光响应，且在酸性条件下两个探针的荧光均增强（Figure 2b）。除此之外，作者探究了两个探针对于其他阳离子探针的竞争选择性。除了立体电子等排体Cd²⁺以外，5当量其余阳离子的加入均没有使化合物9产生荧光，而Cd²⁺几乎不存在于生物环境中，所以对探针的应用不存在影响。接着，作者在竞争性阳离子中添加Zn²⁺，发现大多数情况下荧光得以恢复，但对于Co²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺，荧光并没有恢复（Figure 2c），而由于其在生物学中主要以络合形式而并非游离离子存在，所以无关紧要。

（来源：Chemical Science）

 

基于化合物9和12良好的光谱特性，作者探究了其对细胞中Zn²⁺的成像能力。在确定了其对细胞的低毒性后，作者通过共定位实验对探针靶向能力进行评估。作者分别在Hela细胞中用内质网靶向探针（ER-tracker）、线粒体靶向探针（Mito-tracker）和溶酶体靶向探针（Lyso-tracker）与探针9共孵育，结果表明探针9的荧光与ER-tracker的荧光存在很好的重叠，皮尔逊相关系数为0.92，Mito-tracker和Lyso-tracker的相关系数仅为0.52和0.58（Figure 3）。探针12也表现出类似的实验结果。

（来源：Chemical Science）

 

由于探针9和12具有良好的ER定位能力，作者探究了其对于细胞中游离Zn²⁺水平的成像能力。加入吡啶硫酮锌（一种膜可渗透的锌源）后，探针9孵育的Hela细胞的荧光强度显著增强，而TPEN加入后荧光淬灭（Figure 4a），荧光半定量结果也清晰地揭示了该变化（Figure 4b）。同样的，探针在MCF-7、EC23和HepG2细胞系中也取得了类似的实验结果。

（来源：Chemical Science）

 

基于探针9良好的ER定位能力和Zn²⁺响应能力，作者探究了其对于衣霉素和毒胡萝卜素诱导的内质网应激的成像能力。经两种诱导剂处理后，HepG2细胞的荧光强度明显降低，表明在内质网应激的过程中，游离Zn²⁺的水平减少（Figure 5）。

（来源：Chemical Science）

 

总而言之，作者基于简单的磺酰脲靶向基团，开发了两个用于ER中游离Zn²⁺成像的荧光探针。探针表现出对Zn²⁺良好的荧光响应、对其余阳离子良好的选择性、对pH的普适性以及对细胞的低毒性、ER靶向性和Zn²⁺成像能力，这有利于更好地理解Zn²⁺在不同疾病发生和发展过程中发挥的作用。