生物正交反应是指能够在不干扰生物自身生化反应条件下，在活体细胞或组织中进行的化学反应，由Carolyn R. Bertozzi在2003年提出，可作为一种选择性标记天然产物和蛋白质用于成像的方法。具有特殊官能团的生物分子与探针的官能团互补结合，从而选择性地标记、可视化和/或分离细胞组分，诸如糖类、脂质、核酸和蛋白质等。该反应进行的关键是反应迅速且在低浓度时具有化学选择性，不受生物分子中的亲电、亲核试剂的影响，反应物和产物在生理条件下均稳定，产物体积小且具有化学惰性，以避免干扰目标生物分子的活性。近日，瑞士联邦理工学院的Helma Wennemers教授提出了一种基于异腈和氯肟的生物正交反应（Figure 1）。该反应物具有较小的尺寸、较快的反应速率以及良好的稳定性，且证实了应变促进叠氮-炔环加成反应（SPAAC）的正交性，实现了细胞膜代谢聚糖的标记。相关成果以“The Bioorthogonal Isonitrile−Chlorooxime Ligation”为题发表在J. Am. Chem. Soc.上（DOI: 10.1021/jacs.9b07632）。异腈是生物正交反应的常客，其具有较小的结构和良好的pH稳定性，常与四嗪分子结合用于生物正交反应，而作者则选择异腈与氯肟生成α-羟基亚氨基酰胺的反应标记生物分子。作者猜测在生理条件下，氯肟自发形成中间体腈氧化物Ⅰ，该中间体与异腈反应并形成腈离子Ⅱ，其最终在水的作用下生成所需产物（eq. 1）。首先，作者通过赖氨酸衍生物——异腈1与N-羟基苯甲酰氯2的反应评估异腈和氯肟的反应性。在四氢呋喃（THF）溶液中，反应未发生；随着水（pH 7.4的PBS溶液）的加入，反应在2小时内完成，4.8 mM的反应物迅速转化为α-羟基亚氨基酰胺（Table 1, entries 1, 2）。该结果表明水对于反应的重要性。随后，作者将反应物的浓度降低至微摩尔级别，反应仍以高转化率进行（Table 1, entries 3, 4）；生理温度（37 ℃）下，反应速度加快（Table 1, entry 5）。接着，作者分别添加1当量的羧酸、胺、酰胺、咪唑、吲哚、醇和烯烃探究其化学选择性，惊喜的是，这些物质的加入均不会影响反应的发生（Table 1, entries 6-12）。然而，谷胱甘肽（GSH）之类的硫醇则会干扰反应的发生，但在pH 5的条件下又得以恢复（Table 1, entries 13, 14）。随后，作者通过HPLC实时监测α-羟基亚氨基酰胺3的形成来确定反应的速率常数（Figure 2）。反应动力学分析表明，异腈1的浓度与反应速率和氯肟2的浓度之比（速率/［2］）之间呈线性关系，为二阶动力学定律（Figure2b）。在37 ℃时，二阶动力学常数k=1.04 M-1 s-1。二阶动力学定律说明异腈和氯肟均参与了限速步骤，因此C-C键的形成是限速因素。由此作者推测腈离子Ⅱ是高反应性的中间体，水合作用迅速发生，这与水作为溶剂时的必要性相一致。为了进一步确定异腈-氯肟反应在复杂细胞环境中的可行性，研究者选择N-乙酰甘露糖胺衍生物标记细胞表面聚糖进行代谢标记试验。过乙酰化可增强细胞对N-乙酰甘露糖胺的吸收，在细胞内酯酶和醛缩酶的作用下转化为标记的神经氨酸并整合在糖缀合物中。因此，作者合成了过乙酰化的N-异氰丙酰基甘露糖胺4（Ac4ManNC），其异腈部分与生物素砜化的氯肟5可形成互补探针（Figure 3a）。作者将不同浓度的甘露糖胺4添加到CHO K1细胞的培养基中，并在3天后添加探针5（10 μM， 5 min）共孵育。与未添加4共孵育的对照组（最小的背景荧光信号）相比，实验组的细胞膜显示出强烈的绿色荧光（Figure 3b）。流式细胞仪对荧光强度的定量分析结果表明探针5在300 μM的4处理后具有最强的荧光信号，表现出浓度依赖性（Figure 3c）。细胞活性实验表明300 μM的浓度对细胞几乎没有毒性（Figure 3d）。以上结果均表明了异腈-氯肟的反应在活细胞成像中具有价值。最后，作者评估了异腈-氯肟反应与其他化学选择性反应的相容性。作者合成了叠氮化的N-乙酰甘露糖胺4a（Ac4ManN3），并将CHO K1细胞与异腈4和叠氮化物4a共孵育。3天后，作者加入了带有红色荧光团AlexaFluor 647的DIBO、生物素砜化的氯肟5以及带有绿色荧光团AlexaFluor 488的亲和素以测试4a和4是否融合在细胞膜中。意料之中，绿色和红色荧光团均标记了细胞膜（Figure 4），证明了异腈-氯肟连接所产生的双重标记的重要性。总而言之，异腈和氯肟的偶联是一种有意义的生物正交反应，其具有转化速率高、化学选择性好、结构小巧且稳定等优点。该反应实现了细胞膜上代谢性聚糖的标记成像，为异腈在生物双重标记等化学生物学中的应用提供了一定的基础。
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