【生化】Chem. Sci.：亲/疏水环境敏感型染料用于细胞极性的检测

在细胞内环境中，极性、黏度、温度、氧化还原态和pH等参数的分布、空间排列和组成均不同，这对于维持生物分子的物理化学行为至关重要。另外，细胞内极性与各种细胞过程如细胞增殖、免疫系统调节、细胞迁移以及分子跨细胞转移息息相关，与糖尿病、神经系统疾病和癌症也有着密切的关系。然而，目前所报道的极性探针只能在特定的细胞内区域检测有限的极性，并不能实现定量检测细胞内极性。

近日，韩国亚洲大学的Hwan Myung Kim教授课题组设计合成了一个新颖的双染料探针RPS-1，其包含一种基于极性溶剂激活的螺吡喃分子内环化-开环系统的“turn-on”的极性探针Dye1和一种只在非极性溶剂中发光的具有较大的斯托克斯位移的苯并噻二唑染料Dye3（Scheme 1a）。同时，作者使用该比率型探针定量检测了不同细胞系的极性分布，发现溶酶体是细胞中极性最大的细胞器，而脂滴表现出最大的非极性。相关成果以“Combining hydrophilic and hydrophobic environment sensitive dyes todetect a wide range of cellular polarity”为题发表在Chemical Science上（DOI: 10.1039/c9sc04859f）。

（来源：Chemical Science）

首先，作者在乙醇条件下缩合水杨醛和1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物得到极性探针Dye1，并用不同极性的溶剂（甲苯到水）测定了其吸收和发射强度（Fig. 1）。在非极性溶剂中，Dye1因其闭环结构限制了电荷转移，在328 nm的短波区域产生吸收；在极性溶剂中，Dye1开环并增加了共轭结构，从而使从二乙基苯胺到吲哚盐的电荷转移恢复（Scheme 1b），328 nm处的吸收逐渐降低，549 nm处的吸收逐渐增强，同时在573 nm处产生强荧光（λ_ex=552 nm）。另外，作者通过引入甲基合成Dye2来限制环化反应，证实了Dye1在不同极性溶剂下紫外和荧光的变化是分子内环化的结果。

为了证明改变溶剂极性可以使Dye1分子内环化以及开环过程可逆，作者以甲醇（MeOH）和四氢呋喃（THF）为溶剂反复测试Dye1的荧光光谱（Fig. 1c, d），观察到荧光的恒定变化。

（来源：Chemical Science）

随后，作者在极性和非极性溶剂中分析¹H NMR谱，进一步证明Dye1的环化-开环系统（Fig. 2）。在CDCl₃（非极性）溶剂中，Dye1为闭环结构，并且存在分子内手性中心，因此，螺环形式中的偕二甲基被很好地分离了，分别位于1.14和1.32 ppm。在CD₃OD:D₂O=1:1（极性）溶剂中，Dye1的螺环形式发生开环，分子内结构发生改变且手性消失，偕二甲基的峰只位于1.72 ppm。同时，随着溶剂极性的增加，二氢吲哚的胺带正电，胺甲基的化学位移从2.74ppm移至3.71 ppm。在CDCl₃:CD₃OD=1:1（中等极性）溶剂中，闭环和开环结构共存。

（来源：Chemical Science）

为了探究Dye1和Dye2在生物成像中的应用，作者将其用于Hela细胞的成像。在552 nm光的激发下，Dye1和Dye2均表现出明亮的荧光。在与溶酶体商业探针LysoTracker Green和线粒体商业探针MitoTracker Green共孵育后，所得结果证明Dye1主要定位于溶酶体，皮尔逊系数为0.94（Fig. 3a）；Dye2主要定位于线粒体，皮尔逊系数为0.92（Fig. 3b）。该结果表明，Dye1也许定位于溶酶体中，或者分布在各个地方，但溶酶体的极性相对较高所以只在溶酶体中显示出荧光，因此，为了定量表明细胞内的极性分布，比率型荧光探针的设计显得尤为重要。

（来源：Chemical Science）

苯并噻二唑衍生物Dye3的吸收波长与Dye1类似，但是其较大的斯托克斯位移使其产生近红外荧光，减少了Dye3和Dye1的荧光干扰。Dye1与Dye3通过哌嗪连接，形成比率型极性探针RPS-1。因Dye3的影响，RPS-1在非极性溶剂（甲苯和乙醚等）中表现出510 nm处的吸收；因Dye1的影响，在极性溶剂（MeOH和水等）中表现出550 nm处的吸收（Fig. 4a）。此外，随着溶剂极性的增加，RPS-1在650 nm处的荧光强度逐渐降低，而580 nm处的荧光逐渐增强（Fig. 4b）。比率荧光的两个测量区域分别为565-585 nm（F_yellow）和630-680 nm（F_red），F_yellow/F_red与EN T 值具有高度相关性（Fig. 4c）。另外，RPS-1表现出取决于溶剂极性的F_yellow/F_red比值可逆变化，其行为类似于Dye1（Fig. 4d）。

（来源：Chemical Science）

通过F_yellow和F_red两个通道的比率图像，作者证明了RPS-1可用于反映细胞内各个区域的极性差异。用RPS-1孵育的Hela细胞在F_yellow和F_red通道表现出较大差异的荧光信号（Fig. 5a, 5b），当用伪彩色图像进行比率成像（F_yellow/F_red）时，一眼便可知道细胞每个区域的极性分布（Fig. 5c）。

（来源：Chemical Science）

同时，所有RPS-1所呈现的细胞内极性图像均通过细胞器定位商业探针的共定位实验得以验证（Fig. 6）。在比率图像中，极性最大的红色区域与溶酶体探针重叠，极性中等的绿色区域与线粒体和内质网探针（细胞质）重叠，极性最小的蓝色区域与脂滴探针重叠，溶酶体、细胞质和脂滴被清晰地区分。

（来源：Chemical Science）

最后，除了Hela细胞，作者还在Chang、Huh7和SW837等细胞中观察了细胞内极性分布，发现溶酶体的极性最高（Fig. 7），计算溶酶体的F_yellow/F_red荧光比在1.7-1.9之间，说明其与甲醇和水的极性较为相近（Fig. 4c）。

（来源：Chemical Science）

总而言之，作者基于两个吸收相同、但发射不同的荧光染料设计合成了一种用于细胞器极性检测的比率型探针RPS-1，其能灵敏和定量检测宽范围内极性的变化，清楚地显示出细胞内各个区域的极性差异，为生物医学研究提供一定的帮助。