JACS：Azulene衍生双光子荧光探针用于ROS/RNS的生物成像

活性氧（ROS）和活性氮（RNS）是许多生理病理过程的重要中间体。过高的过氧化氢（H₂O₂）产生与癌症和神经退行性疾病等许多疾病的发病机制息息相关。同样的，过氧亚硝酸盐（ONOO^-）由于其强氧化性和硝化作用可以不受控制地与各种生物分子反应，与各类心血管疾病、神经退行性疾病、炎症以及癌症有着密切的关系。基于此，运用合理的技术来阐明ROS/RNS在生物系统中的作用显得尤为迫切。双光子荧光探针具有近红外区域的激发波长，更深的组织穿透，成为解决上述问题的一种不错的选择。

 

近日，韩国亚洲大学的Hwan Myung Kim和英国巴斯大学的Tony D. James，Simon E. Lewis报道了一种新的生物成像荧光团azulene，其与硼酸酯受体基序相连后，成为一种有效的双光子荧光探针，可用于活性氧的检测并表现出良好的细胞穿透性、优异的过氧亚硝酸盐选择性和光稳定性以及极低的细胞毒性。相关成果以“Azulene-Derived Fluorescent Probe for Bioimaging: Detection of ReactiveOxygen and Nitrogen Species by Two-Photon Microscopy”为题发表在J. Am. Chem. Soc.上（DOI: 10.1021/jacs.9b09813）。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

Azulene是一种非替代性的双环芳烃，与萘异构，但具有明显不同的性质，有极高的固有偶极矩（1.08 D），因共振结构使得较小的环具有较高的电子密度且两个环均为离散的6π芳香体系（Scheme 1a）。在ROS/RNS的存在下，与七元环相连的硼酸酯基团的碳-硼键发生氧化形成碳-氧键，从而表现出荧光的变化（Scheme 1b），这是因为硼酸酯是吸电子的（Scheme 1c），而羟基是给电子的（Scheme 1d）。硼酸酯的电子效应减弱了azulene的固有极化，导致Az-6-Bpin系统的分子内电荷转移（ICT）效应减弱；羟基则增强了azulene的固有极化，使得Az-6-OH系统中的ICT效应增强、荧光增强。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

6-羟基Azulene由于酮式互变异构体的存在，具有较差的稳定性。因此，作者通过在Azulene的1位、3位引入酯基，并在2位引入供电子的氨基得到最终的探针1（Scheme 2a）。氨基的取代增强了与固有极性相矛盾的共振效应（Scheme 2b），酯基不仅增加了产物2的稳定性，还增强了共振效应从而增强了azulene的固有极性（Scheme 2c）。

（来源：J.Am. Chem. Soc.）

作者对探针分子1和氧化产物2进行DFT计算，得到了每种化合物的分子轨道（HOMO，LUMO和LUMO+1）（Figure 1）。另外，作者幸运地在THF/正己烷中得到了化合物2的晶体结构（Figure 2）。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

随后，作者在PBS缓冲液/甲醇体系中测试了探针的荧光发射光谱（Figure 3）。在350 nm光的激发下，探针1基本不显示荧光，而氧化产物2在483 nm处显示出明亮的荧光信号。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

pH滴定实验表明，在较低的pH或pH高于8的条件下，化合物2的荧光强度显著降低，在pH 7-8条件下，其表现出最大的荧光强度（Figure 4），这使得探针用于细胞成像具有可行性。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

接着，作者测试了探针1对ROS/RNS的选择性。诸多文献证实，硼酸酯受体对于ONOO^-和H₂O₂均有响应，但ONOO^-的高亲核性使得其反应速率远高于H₂O₂。实验结果表明，在等摩尔浓度ROS条件下，探针1在5和30分钟时均显示出对ONOO^-的高选择性，而对H₂O₂几乎无响应（Figure 5）。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了进一步探究探针1检测活细胞中ROS的能力，作者分别测得经H₂O₂（2 mM）和ONOO^-（100 μM）预处理的RAW 264.7巨噬细胞中1的荧光强度。与仅用探针1染色的阴性对照相比，用ROS预处理的细胞显示出3倍的荧光增强（Figure 6b，c）。除此之外，用PMA、脂多糖/γ干扰素刺激巨噬细胞释放ROS或者用SIN-1（ONOO^-的外源）对细胞进行预处理后，再用探针1对细胞进行染色，荧光强度明显增加（Figure 6d，e，g）。而用ebselen（超氧化物消除剂）共同处理后，ROS诱导的荧光强度又显著降低（Figure 6f，h）。以上结果均表明探针1可用于生物体中ONOO^-和H₂O₂的检测。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者探究了探针1可视化活体中ONOO^-和H₂O₂的能力。作者将大鼠的海马体切片，用探针1对其进行染色。与细胞实验结果一致，TPM图像表明其在CA1区表现出微弱的荧光信号（Figure 7a，e），而PMA和SIN-1的处理增强了荧光信号（Figure 7b，c），ebselen的处理又使荧光信号减弱（Figure 7d，f）。这证实了探针1可用于组织中ROS的检测。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

总而言之，作者基于azulene荧光团设计合成了一种新型双光子荧光探针，其具有较好的细胞渗透性、光稳定性和较低的细胞毒性，可用于在细胞和活体组织中的过氧亚硝酸盐和过氧化氢的检测。