【生化】山东大学卞小莹、张友明课题组：基因组挖掘揭示酰基化去铁胺的生物合成途径

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Desferrioxamine（DFO）是一类非常重要的天然产物，其中Desferrioxamine B（DFOB）已经被商业化用作治疗人体铁过载。近日，山东大学卞小莹、张友明课题组通过基因组挖掘结合经典的铁载体实验确定了一类新型DFO类铁载体——Fulvivirgaminde（FVM）。通过异源表达及底物添加实验初步确定了其生物合成途径。相关成果发表于Org. Lett.（DOI: 10.1021/acs.orglett.9b04490）。

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本文研究人员在对海洋样品来源的一株滑动细菌Fulvivirga sp. W222进行基因组挖掘的时发现其中含有一个DFO类似的基因簇，但是其中包含两个之前未被确认功能的基因fulE和fulF（图1）。通过BLAST发现，fulE可能是一个转运蛋白，而fulF是一个含有未知功能膜蛋白，而且更重要的是这两个基因在拟杆菌中是相对保守的，因此推测这个基因簇的产物很可能是一类新的DFO。

 

Figure 1. Predicted ful BGC from strain W222 and the similar DFOB BGC from Streptomyces coelicolor A3(2).

（来源：Org. Lett.）

利用其发酵产物进行CAS实验，研究人员检测到了铁载体活性，这说明在实验室条件下铁载体的基因簇是激活状态的，之后通过添加铁离子抑制铁载体的产生，比较两者的LC-MS图谱初步确定了这一系列铁载体的分子量（图2），初步判断其中约含有近20种铁载体。通过色谱分离，研究人员得到并解析了其中的四种化合物fulvivirgamides A2, B2, B3, B4 （compound 1–4）（图3）。作者查阅文献发现这是一类DFOG₁的初级氨基氮原子被一系列脂肪酸或芳香族脂肪酸酰化的衍生物，命名为fulvivirgamide（FVM）。由于其二级质谱非常有规律，因此，利用解出的结构，研究人员推测出了其余FVM的大致结构。

Figure 2. Basic peak chromatograms (BPCs) of DFO siderophores produced by strain W222 (red trace) and inhibition of siderophore production by Fe(III) (black trace).

（来源：Org. Lett.）

Figure 3. Structures of compounds 1−4.

（来源：Org. Lett.）

由于对W222的基因操作比较困难，研究人员采取了异源表达的策略。首先，将fulA–fulD分别克隆到了商业化载pRSFDuet-1与pETDuet-2上，转入BL21(DE3)中后，在其发酵产物中顺利检测到了DFOG₁（未被酰化的FVM），但并没有检测到FVM类的化合物。而当把克隆有fulF的pACYCDuet-1质粒转到BL21(DE3)::fulABCD中后，在其发酵产物中检测到了长链脂肪酸酰化的FVM，特别是在其发酵培养基中添加对应的长链脂肪酸后，FVM的产量有了明显的提高（图4）。为了确定脂肪酸的来源，研究人员将同位素标记的14烷酸添加到发酵培养基中，顺利检测到了同位素标记的FVM。但并未在BL21(DE3)::fulABCDE中检测到任何FVM，说明FulE可能与酰基化的过程无关；同时也没有在任何转化子中检测到中短链脂肪酸或脂肪族脂肪酸酰化的FVM，至此还不能确定是否还有其它基因参与了对DFOG₁中短链脂肪酸酰化的过程，但可以肯定的是FulF参与了DFOG₁长链脂肪酸酰化的过程。

 

Figure 4. UPLC-MS analysis of DFOG₁ and FVMs expressed by BL21(DE3). Extracted ion chromatograms (EICs) of corresponding compounds are shown. *FVMB₁₄ represents the isotope-labeled FVMB₁₄.

（来源：Org. Lett.）

为了进一步确定FulF的催化底物，研究人员将DFOG₁添加到了发酵培养基中，在只表达fulF的BL21(DE3)的发酵产物中检测到了FVM的产生，这说明FulF可以催化DFOG₁的酰基化从而生成FVM。基于文献中报道的DFO的生物合成途径以及本实验结果，研究人员提出了FVM的生物合成途径（图5）。但由于缺少相应的底物，本文并没有检测FulF是否可以催化其它底物的酰基化，例如单体HSC，以及二聚体等等，所以这一生物合成途径还有待进一步优化。

Figure 5. The proposed biosynthetic pathway of partial FVMs.

（来源：Org. Lett.）

综上，研究人员发现了一类初级氨基氮原子酰基化的产物（FVM），并通过异源表达和底物添加实验初步确定了一个新的酰基转移酶超家族的成员FulF的生物学功能，并提出了FVM可能的生物合成途径。