【催化】JACS：酶催化卞位和烯丙位C(sp3)−H的一级胺化反应

脂肪族的一级胺普遍存在于天然产物、药物和功能材料中，尽管已经有很多合成一级胺的方法被报道，然而，直接在sp³杂化的碳原子上引入一级胺却还没有相关的报道。直到近日，美国加州理工的Frances H. Arnold课题组报道了利用改造的细胞色素P411（P450s中血红素铁的轴向配体由Cys替换为Ser），实现了苄位跟烯丙位C(sp³)−H的一级胺化反应，此反应具有较高的化学、区域以及立体选择性，并且可以在制备规模下进行。相关研究成果发表在J. Am. Chem. Soc.上（DOI: 10.1021/jacs.0c03428）。

P450_BM3本身能够催化脂肪酸发生羟基化反应，研究人员通过定向进化，已经实现了利用P450_BM3突变体来进行一些卡宾、氮宾转移反应。之前已有利用磺酰氮宾中间体来合成各种磺酰胺的报道，作者设想，如果反应过程中能直接生成高价的没有取代基的铁-氮宾物种，那么就有可能发生直接一级胺化。作者选取丝氨酸取代P450_BM3中跟金属配位的半胱氨酸，以此增加Fe(III)/Fe(II)的还原电势，并且使得体系中也不需要额外的还原剂。

作者以四氢化萘（1a）为底物，通过其与羟胺酯（2）的反应来测试酶催化的效果（图1A）。作者选取了之前在磺酰胺化反应中具有较好催化活性的P411-B2突变体，并成功检测到苄位胺化的产物，但是总转换数（TTN）只有8。于是，作者以P411-B2作为起始模版，试图通过定向进化的方式来提高催化的效率跟选择性。通过观察P411-B2突变体的晶体结构（图1B），作者选取靠近催化中心或者比较灵活的环上的残基进行定点饱和突变（SSM）。经过四轮SSM并引入突变G268P、V78M、L437F以及T327A，作者将ee值提高到64%，TTN提高到290。之后作者又引入突变E267D和S438G，得到最终突变体P411_BPA，进一步将ee值提高到93%，TTN提高到750（图1C）。

Figure 1A: Reaction scheme of benzylic C(sp³)−H primary amination; Figure 1B: Crystal structure of a variant closely related to P411-B2;  Figure 1C: Evolutionary trajectory of benzylic C−H primary aminase (P411_BPA). 

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

得到P411_BPA突变体之后，作者开始着手评估此反应的底物适用范围（图2）。不同环大小的底物以及芳环上不同电性的取代基都具有很好的兼容性。作者还测试了一级、二级、三级苄位C−H的胺化反应，发现相较于一级苄位C−H，胺化更容易发生在二级和三级苄位C−H上。

Figure 2: Scope of benzylic amine products.

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者后续又尝试对烯丙位C−H进行一级胺化反应。以5a作为反应底物，以上述得到的P411_BPA为起始，其经历两轮饱和突变，引入N395R和S438A得到P411_APA，使总转化数达到3930，ee值达到94%（图3A）。同样的，作者对底物的范围进行了研究，结果显示，P411_APA对于大部分短链的脂肪族和芳香族化合物具有不错的转化和选择性（图3B）。

Figure 3A: Evolutionary trajectory of allylic C−H primary aminase (P411_APA); Figure 3B: Substrate scope of allylic C−H primary amination 

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总的来说，作者通过改造得到了催化一级胺化反应的酶P411_BPA和P411_APA，两者分别对苄位和烯丙位的C(sp³)−H展现出很好的催化活性。具有此种活性的酶或许在自然界中也存在，该项工作也为后续研究提供了很好的基础。