华夏酒报·中国酒业新闻网 作者：赵纪文 信春晖 张辉 编辑：张怡 时间：2008-12-1 7:19:50
订阅邮箱快讯泥窖是浓香型白酒酿造的基础，“老窖产好酒”是数百年来酿酒师的经验总结。但窖泥的自然老熟要经历一个相当长的过程：泥色由黄转乌，又逐渐转变为乌白色，并由黏性变绵软再变为硬脆。老窖泥质软无黏性，泥色乌黑带灰，并出现红绿色彩，带有浓郁的窖香。
随着科学技术的发展，人们逐渐揭开了百年老窖之谜。老窖出好酒，其根本原因，在于长期连续的酿酒发酵中产生的有机酸、醇类、二氧化碳等浸润渗入窖泥中，逐渐富集起与产香有关的一些厌氧功能菌。随着窖泥使用年限的增加，窖泥中聚积起越来越多的厌氧功能菌群，形成了浓香型白酒特有的微生物区系。正是窖泥中这些功能菌参与了曲酒香味物质的合成，才产出窖香浓郁，回味悠长的曲酒。
扳倒井自上世纪80年代开始富集老窖泥中的微生物，以培养人工老窖。
上世纪90年代，公司又以己酸菌等厌氧功能菌作为菌源，培养制作老窖泥，皆取得一定的效果。
近几年，扳倒井公司逐步采用多种厌氧功能菌进行纯培养，然后混合发酵培养老窖泥，取得了较好的效果。现将我们制作窖泥的几点体会作以下浅述，有不当之处，还望各位专家、同行批评指正。
一、窖泥中的重要微生物
1 己酸菌
己酸菌是制作人工老窖的首选功能菌。己酸菌的分离，一般用传统的巴氏培养基或改良巴氏培养基；富集，用液体培养基。现在，一般采用纯种己酸菌逐级扩大培养的方式。
在己酸菌培养过程中，我们分别用巴克尔培养基、乙酸钠培养基及酵母发酵液做过培养，结果三者活菌数较为接近，都是优良培养基。其中，酵母发酵液较为突出，始发快，24h即进入旺盛期，菌体健壮，有酯香，无臭味；巴、酵混合培养基效果更好，培养液发酵旺盛，活菌数多，丁酸产量尤为突出，并能生成较高的己酸乙酯。
土壤的界面对土壤微生物有以下三点重要作用：
（1）能使菌的代谢表面积扩大，以吸附菌体，同时起到浓缩营养的作用，还能使缓冲力增加。
（2）除界面之外，泥中的微量未知生长因子，对微生物的生长和代谢有明显的促进作用。
（3）在培养液中直接添加泥土，既有界面作用，又能起到供与营养和未知生长因子的双重作用，添加窖泥的效果尤为突出。它较空白的活菌数增长3.5倍。
2 丁酸菌
丁酸菌也是窖泥中的重要功能菌。丁酸菌的培养和分离与己酸菌大致相同。
丁酸菌不但能产丁酸，而且大部分分离株在有碳源的情况下，还能产少量己酸。
在富集培养基中，凡不产气的都不产己酸，而产气的有可能产己酸。
实验证明，丁酸、己酸的产生并不是同步的，而是此起彼伏，系先产丁酸，丁酸量随着己酸的上升而下降。这说明己酸生成过程中，丁酸是一个重要的过渡阶段。
3 甲烷菌
甲烷菌是一个特殊的菌群。它有特殊的代谢功能，是在没有外源电子受体的条件下，还原二氧化碳为甲烷的微生物。
甲烷细菌是一种严格厌氧的细菌。它们对氧非常敏感，在氧化还原电位高于0.33伏时，不能生长。
甲烷菌的分离，必须在严格厌氧条件下进行，可利用洪格特技术。
甲烷菌与己酸菌在老窖泥中共栖生长。它的重要作用是与己酸菌和其它氢型发酵菌相互偶联，以实现“种间氢转移”关系。因此，甲烷菌与己酸菌共栖，不仅有利于己酸发酵的进行，而且可使窖泥内各种产H2型发酵得以有效进行。
4 甲烷氧化菌
甲烷氧化菌是一类能以CH4作为唯一碳源和能源，在无机盐培养基上生长的自养细菌。
甲烷氧化菌存在于中、上层发酵糟中，而窖墙、窖底泥中，则存有甲烷产生菌。后者产生的甲烷是前者赖以生存的条件。它们共同参与了酒窖生态环境中的碳素循环过程。
此外，作为一种特定区系的微生物，很可能在大曲酒酿制过程中发挥特殊的功能，参与特定物质的转化。甲烷转化的生物化学过程，以及甲烷氧化菌对多种有机化合物的辅氧化作用，对优质浓香型大曲酒中各类醇、醛、酸、酯的谐调有一定的联系。
5 酵母菌
酵母菌存在时，己酸菌更加活跃，对曲酒的香味成分形成有促进作用，对窖泥的老熟生香也有一定的效果。但其机理尚待研究。
6 放线菌
在培养己酸菌及窖泥时，添加放线菌，对己酸菌活菌数的增长和己酸及其酯类的生成，都有显著的促进效果。
二、人工老窖泥的培养
1 菌种培养时应注意的几个问题
1.1 在合成培养基中，酯酸钠和乙醇是必不可少的基质，否则，己酸就不能合成。用其它的醋酸盐代替醋酸钠也可以。
酵母膏含一定量的生物素，能促进己酸的合成。酵母膏的量不足或质量低劣，都会影响己酸的合成，而其它无机盐影响不大。
用酒糟浸出液作配料用水，可以取代酵母膏和无机盐。
1.2 己酸菌（或窖泥）培养液有时会变黑，有的出现黑色沉淀，有的出现黑色膜状物。出现这种情况有可能是以下几种原因：
（1）强氧化作用
采用高锰酸钾作消毒剂，与铁罐起强氧化作用，产生FeO（黑色）、FeO3（红色或黑色）、Fe3O4（黑色）。但是，这种变黑没有H2S恶臭，黑色成片状或块状，静置后，可沉淀下来。
（2）氨细菌感染
培养液中有酵母膏（或酵母自溶物），而且在不断地传代过程中，还有部分细菌残体，氨细菌可利用这些作为它的营养，开始繁殖。分解蛋白质的结果，产生H2S气体，而H2S又与Fe离子结合，产生FeS（黑色）。也就是说，污染是变黑的原因，使用铁罐是变黑的条件。
（3）培养基pH值的影响
己酸菌属于变形杆菌，是梭状芽孢杆菌。它除了有己酸合成一套酶系外，还有另一套酶系。在环境条件正常时，它可以通过乙酰辅酶A的作用，形成丁酰辅酶A，进而再形成己酸。
但在环境改变、不适于己酸菌合成己酸时，即pH值过高时，就会使另一套酶系产生作用。
在肽酶的作用下，蛋白质进行分解。首先脱掉氨基酸分子上的氨基，进一步产生H2S，由此产生恶臭，并造成培养液变黑。当菌液变黑时，培养基的pH值在8以上，甚至更高。
1.3 浓香型曲酒窖泥中的己酸菌等菌株，因长期生活的特定环境与合成培养基截然不同，所以，用合成培养基进行菌种分离和种子培养，虽然己酸菌能正常生长繁殖，但接种到酒糟、窖泥培养基中，在窖内即使能起作用，也会有一个较长时间的环境适应过程。因此，最好用酒糟浸液作培养基，作种子的筛选、纯化和各级种子的培养。
1.4 根据大多数浓香型白酒厂的情况，出窖糟和黄水的pH值大致为3.4－4.0，若培养液采用pH在6.0以上的环境中培养，后又接种到窖内，使菌种又要有一个适应过程。因此，菌种培养时，最好采用pH4.5－5.5。
1.5 窖泥微生物在浓香型大曲酒的香味生成上，具有重要作用。只有在多种微生物的作用下，酶系复杂，酒的香味才丰满细腻。纯种微生物的酶系因单纯，往往会造成酒的香味单调。而采用泥种培养窖泥，若泥种质量较差，窖泥功能菌种类和数量不足，生产出来的酒也会香味单调。为了相互取长补短，充分发挥各自的优势，可以采用泥种与“纯种”相结合的方式，即以老窖为基础，加入人工分离的种子，予以强化，效果会更加显著。
2 培窖材料
2.1 菌种
（1）纯种分离、培养的各种窖泥功能菌。
（2）以老窖泥为种子作培养液的混合菌株。
2.2 材料
（1） 新泥
选用优质黄黏土或红黏土，要求土质细腻绵软、无沙、微酸性。
（2）窖皮泥
多次封窖用的老窖皮泥，要求无霉味。
（3）优质泥
含腐殖质较多，微酸性、黏性熟土。要求晒干后粉碎。
（4）老窖泥
（5）大曲粉
（6）豆粕
（7）黄水
发酵正常的老窖黄水。
（8）营养无机盐
（9）酒头、酒尾、丢糟粉
（10）酯化液
3 培窖材料的重要作用
3.1 腐殖质，是高分子复杂化合物及植物残体或其分解产物的一些物质相互作用的混合物，含有芳香族和氨基态及环基的有机含氮物，是土壤微生物的重要营养源。
3.2 磷（有效磷），是增强土壤细菌代谢的重要元素。
细菌生长主要靠细胞增生，新细胞的形成又必须有核蛋白，而磷是核蛋白的重要物质成分；同时，细菌吸收的成分要经分解、转移、消化和利用等代谢过程，才能满足它生长发育的需要。由于磷在其中起着重要作用，因此，磷是己酸菌大量增殖的必需物质。同时，磷又是参与乙醇、乙酸化合成己酸这一发酵过程的重要物质。所以，磷含量的多少是衡量窖泥质量优劣的一项重要指标。
3.3 酵母的溶物，是酵母破败自溶后的产物，含有核糖、核酸及维生素B1、B2和叶酸等，都是促进己酸菌增殖的重要物质。因此，己酸菌发酵时，必须有大量的酵母自溶物作营养基，才能促进发酵。
3.4 大曲粉，内含大量的酵母、霉菌、细菌和淀粉。
培养窖泥初期，大曲粉对泥土起接种与升温的作用。以后，曲粉中的微生物大量死亡，形成菌体自溶物，供土壤微生物用，所含淀粉可逐渐转化为腐殖质，也可为细菌所用。
3.5 黄水，内含有机酸、乙醇、腐殖质、酵母自溶物，以及一些经驯化的生香菌类。
3.6 氮源，如豆饼粉、尿素、硫铵等，都是微生物生命活动离不开的氮源。但添加量不宜过多，以免带来异味。
3.7 酒精、酒尾，主要作为己酸菌等细菌的一种碳源，不宜加入过多，以酒精含量的2%为宜。
4 人工窖泥配方设计
4.1 黄黏土4500公斤，窖皮泥500公斤，液体磷铵60公斤，黄水120公斤，丢糟275公斤，麦曲50公斤，酒尾50公斤，老窖泥富集培养液和己酸菌、甲烷液等125公斤。
将以上材料混匀、踩揉、堆积，密封发酵，保温30℃左右，嫌气发酵60天。
4.2 黄黏土900公斤，大曲粉50公斤，豆粕10公斤，酒头、酒尾折合95°酒精8公斤，己酸菌、生香酵母等功能菌15公斤，营养盐6公斤，老窖泥富集培养液20公斤。
将以上材料混匀、踩揉、堆积，密封发酵，30天以上。
4.3 新泥、窖皮泥、优质泥共4000公斤，液体磷铵150公斤，麦曲粉50公斤，丢糟粉50公斤，酒尾、黄水适量，再加250公斤老窖泥培养液及功能菌富集培养液。
将以上材料全部混匀，踩至柔熟，密封发酵1个月以上。
5 窖泥培养注意的问题
5.1 不要根据窖泥厌氧微生物的营养需要，盲目添加水果、粮谷原料等，而忽视加黄水、尾酒等。
5.2 若试图使窖泥带有特殊的香味，而添加中药材、植物花草或有机酸酯，结果会适得其反。因为曲酒香味物质的生成，主要靠微生物酶的作用。
培养窖泥的实质，是培养泥中的优质有益菌类，而不是提供窖泥作增香来源。
5.3 不易在黄泥中加入大量污泥。因为来自污泥的微生物大多是与酿酒无关的细菌，因此，这样培养的窖泥会带有异杂味。
5.4 不能只把黄泥、肥土加过磷酸钙、尿素等堆积起来发酵，这样做会因为缺少老窖泥培养液，而致使发酵后的人工老窖泥带氨臭味。
5.5 微生物种类不能过于单一。若只用己酸菌液培养窖泥，会使产酒香味成分单一，酒质不全面，从而影响质量。
三、几种功能菌之间的重要关系
在正常窖泥的老熟过程中，窖泥中的全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾及有机质含量均有所增加。窖泥的分散系数、结构系数，以及团聚度也随窖龄的延长而呈增加趋势。窖池中也逐步形成己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原等一组优化的厌氧菌群。
己酸菌在窖泥中适应生长繁殖。它的富集是窖泥渐趋成熟的标志。
甲烷菌生长要求在-300mV以下的氧化还原电位。它在窖池中富集，表明窖池中厌氧生态环境的成熟。由于甲烷菌能通过“种间氢移”机制，降低反应自由能和环境氢分压，使己酸菌利用乙醇氧化反应为乙醇酸的反应能顺利进行。甲烷可通过转基因作用有效地促进己酸生成。甲烷菌还能改变丁酸产物，避免丁酸过量生成。
窖池中硫酸根浓度处于正常情况时，硫酸盐还原菌氧化乙醇、乳酸等产生乙酸、氢气和二氧化碳，不仅能避免乳酸过量，而且生成的乙酸是己酸的前体，有利于己酸产量的提高，所产生的氢气有利于甲烷菌的生长繁殖。
乳酸菌是兼性厌氧菌。它的生长会消耗环境氧，降低氧化还原电位，为厌氧生态环境的形成创造条件。
硝酸盐还原菌能有效消除对厌氧发酵不利的NO3-，产生N2、NO和NO2。在有机质含量高的土壤中，硝酸盐还能将NO3-转化为CO2和NH3，作为窖内空间的填充气体，阻止氧气进入，维持窖内环境（图1）。
总之，窖泥中的微生物代谢可分为两个方面：一是窖泥中有机酸的代谢过程；二是解除有机酸代谢过程中的底物抑制，以及调整营养物中物质的不平衡。前者是产生己酸的途径，后者是代谢途径的调控（图2）。
四、窖泥老化机理及成因分析
在浓香型曲酒的酿造过程中，有些人工老窖使用一段时间后，池内窖壁上逐渐起碱、变硬，表面析出白色晶体或细长的针状结晶，酒质下降。这就是窖泥老化现象。
1 窖泥老化的特征
1.1 水分严重不足。由于窖泥老化变硬，含浆量下降。水分不足，势必影响菌类摄取营养物质及生长繁殖。
1.2 pH值偏低，在4.0左右，氧化还原电位较高，在150～200mV之间。
己酸菌适宜的pH为5.5～6.5，如果pH过低，将严重影响己酸菌的繁殖及代谢。窖泥开始发酵时，必须加强对pH的控制。
1.3 营养成分枯竭或失调。营养成分不足，致使有益菌的繁殖受到阻碍并加速衰退。更多的时候是有的过剩，有的不足，营养比例失调也会抑制有益菌的生长。
1.4 有盐的结晶（乳酸铁、乳酸钙），活性铁（乳酸亚铁）含量高。
在己酸菌培养基中，只要有微量的乳酸铁和乳酸钙，则活菌数明显下降。窖泥中，当乳酸铁及乳酸钙的含量增加到0.05～0.1%时，就会发生窖泥老化。己酸菌数及己酸量都明显下降。两者相比，乳酸铁的危害性比乳酸钙大。
2 窖泥老化的机理
在人工老窖泥的制作过程中，各种成分经接种发酵后，有益功能菌未能迅速繁殖形成优势菌群。加之在以后的使用过程中，又未能营造适宜的环境条件，致使一些产酸菌，如乳酸菌大量繁殖产酸，降低了窖泥的pH，使对窖泥微生物具毒性作用的水溶性铁离子浓度增大，并出现乳酸亚铁的积累和结晶。此时的窖泥，因失去产香能力而老化。
3 窖泥老化的重要原因
乳酸亚铁对微生物有强烈的毒害作用。它是导致窖泥老化的最重要原因。促成窖泥老化的是活性铁的积累，与土壤中铁的含量无直接联系。因此，研究铁元素在窖泥中的形态变化规律，对了解窖泥老化的过程有重要意义。
3.1 铁在窖泥中的形态变化
当窖泥氧化还原状况发生变化时，铁的形态也随之发生变化。
窖泥的氧化还原电位Eh值≥+200mV时，窖泥处于氧化态或弱还原状态，铁以Fe3+形态存在。但使用中的窖泥Eh值很少有大于+200mV的情况。
当Eh值在+200mV以下时，Fe3+开始被还原，Fe2+开始出现，活性铁含量不断增加（活性铁主要包括水溶性铁、交换铁及络合铁）。在窖泥氧化还原电位降到0mV时，Fe3+完全消失。
当窖泥进入强度还原状态，Eh降到0mV以下时，窖泥中的硫酸根在硫酸还原菌的作用下被还原生成硫化氢。此时，窖泥中的Fe2+与H2S作用，生成难溶性的FeS沉淀，活性铁重新被固定。
3.2 活性铁含量与pH的关系
窖泥中亚铁的存在形态与pH有着密切的关系。活性铁含量随pH值的降低而增大，低于pH4后，活性铁含量增速减缓。随着pH的上升，沉淀态亚铁在窖泥总量中所占百分数增加，而活性亚铁所占的百分数减小。
土壤还原状态的发展，能使土壤或土壤溶液的pH上升，而且其变化有比较固定的比例关系，即氧化还原电位每下降60mV，土壤pH会上升一个单位值。
因此，保持较高的pH值，是防止活性铁过量的重要手段。
3.3 窖泥老化的主要过程
窖泥老化现象多出现在老窖形成之前的新投产窖池。因为窖墙是新黄土筑成，氧化还原电位较高，一般在+400mV以上，因此，敷上的窖壁泥即使是非常成熟的人工窖泥，或是直接通过老窖的窖底泥移植的，也会由于只是局部老熟，其氧化还原电位缓冲能力较弱，受糟醅淋浆渗透的影响，而造成Eh上升、pH下降及活性铁含量大幅上升，出现老化现象。
在窖池发酵的厌氧条件下，当富含乳酸等有机酸的糟醅淋浆向窖壁泥渗透时，能加速窖泥中铁的还原与溶解，并生成具有一定溶解度的有机酸亚铁盐（以乳酸亚铁盐为主），这些乳酸亚铁盐可随淋浆的溶解作用而流失。但在窖泥水分不足的情况下，乳酸亚铁的生成速度远大于淋溶速度，于是，便出现了乳酸亚铁的积累和结晶，并对窖泥微生物产生毒害作用。此时的窖泥失去了产香功能，成为老化窖泥。
五、向陈年老窖转化的重要措施
百年老窖的形成，是在窖泥微生物生命活动推动下的一个缓慢的、渐进式的物理化学变化过程，即窖池氧化还原电位，由弱度还原或中度还原向强度还原推进的过程，以及由此引发的一系列在窖泥微生物参与下的化学变化过程。而窖泥老化，则是这一过程在中度还原阶段的一个小插曲。
窖泥老化也是一个缓慢的、渐进式的过程，但并不一定是老窖形成过程中必然经历的阶段。只要能人为提供恰当的营养和环境条件，推动窖泥微生物的代谢活动，加速还原化过程，即加速氧化还原电位下降速度，便可跨越这一阶段。
1 老熟窖泥的形成机理
在厌氧条件下，窖泥微生物的活动结果是让窖泥氧化还原电位不断下降。
但是，对于新窖中上部，若出现乳酸亚铁的积累和毒害现象，窖泥微生物会无法生存与代谢，则氧化还原电位下降的趋势被中止，直至毒害作用消除；而对于窖池中下部窖泥，因含丰富的移动水分或窖泥受黄水浸泡，乳酸亚铁的淋溶速度与生成速度能保持平衡，不会造成乳酸亚铁的积累和毒害，窖泥微生物的活动旺盛，则窖泥氧化还原电位将持续下降，进入强度还原状态。
当窖泥处在强度还原状态时，SO42-在窖泥微生物的作用下被还原成H2S，进而与Fe2+离子反应，生成FeS沉淀，使活性亚铁转变为沉淀态亚铁。因此，黑色FeS的生成是老窖形成的重要标志。以后只要注意合理使用和保养窖池，保持其厌氧环境，便不会出现老化现象。
老熟窖泥的典型物理化学特征是：pH较高，一般大于pH7；氧化还原电位较低，处于强度还原状态，Eh＜0mV；颜色乌黑色，标志FeS大量生成，窖泥中活性铁含量低。
2 几点重要措施
2.1 注重营养均衡
窖泥配方不求营养成分高，而是注重窖内发酵中窖泥的营养变化，使其逐渐趋于合理。窖泥功能菌的碳源丰富，酒醅中淀粉水解成葡萄糖。而葡萄糖进一步发酵代谢产生的乙醇、乙酸等，都可以作为微生物的营养和能源。
酒醅中高粱的蛋白质不易被利用，氮源主要来自制曲用小麦。因大曲蛋白酶活力低，因此，窖泥必须采用无机、有机氮源结合方式供给，以便保证长期需要。
磷、钾一般在窖内发酵中，从酒醅中得到补充，达到微生物适宜浓度即可，不必过量储备。
2.2 为适应环境添加的黄水、酒糟等副产物不宜过多。因为微生物的代谢产物对微生物的生长繁殖多为不利，而且会抑制代谢产物的进一步产生。
2.3 重视腐殖质的作用
富含氮源的有机物，在微生物酶的作用下，形成简单的有机化合物和微生物代谢产物合成物，最终转化为CO2、H2S和多元酚、氨基酸、多肽和糖类。最后，多元酚氧化为醌，醌与氨基酸缩合成腐殖质。
腐殖质的质化过程主要是在嫌气条件或好气与嫌气条件交替作用下进行的。但只能在水、热稳匀时，腐殖质的积累趋势才大于分解趋势。水、热变化越剧烈，越不易形成与积累腐殖质。一般来说，窖泥使用的时间越长，腐殖质积累得就越多。窖泥黑色的深浅，与腐殖质含量呈正相关。
腐殖质的含量非常重要。它可以为微生物提供充足的水分和养分，所含极微量的四氢叶酸可刺激己酸菌的生长，所含的生物素H可促进丁酸梭状芽孢杆菌的生长和繁殖。此外，它还可以缓解乳酸钙、乳酸铁的生成，避免窖泥的板结退化。
2.4 重要的M类微生物
在窖泥中有一类微生物，除了对己酸的生成有一定作用外，还可以调节pH值。
在浓香型大曲酒糟醅的发酵过程中，无论是发酵糟醅，还是其发酵副产物黄水的pH值都在3.5左右，而窖泥与发酵糟醅、黄水的长期接触过程中，优质窖泥中的M类微生物就起到将输送入窖泥中的有机酸进行分解的作用，从而确保了窖泥的pH值稳定在5～7范围内，以促进己酸菌、丁酸菌在适宜的pH值条件下，产生浓香型大曲酒所必需的己酸、丁酸等物质。
退化窖泥中，绝大部分是属于窖泥中M类微生物的数量及比例不合理的情况。因此，窖泥中除了要有足够的己酸菌外，还必须有合理的M类微生物，才能使窖泥的pH值保持在适宜于己酸菌生长、繁殖和代谢的范围内。
