导读
高危型人乳头瘤状病毒(HR-HPV)持续感染宫颈后,通过其基因产物干扰正常的细胞周期调节,导致细胞的连续增殖与恶性转化。p16INK4A基因产物是细胞周期素依赖性激酶抑制物(CDKI),负性调节细胞周期,由于HPVE7蛋白阻断了p16INK4A的细胞周期调节级联,因此在HR-HPV感染的宫颈癌及癌前病变组织中出现p16INK4A过表达。p16INK4A与HPV联合监测将提高宫颈癌筛查的有效性,有助于宫颈癌的诊断与鉴别诊断。
p16INK4A过表达的分子机制
在正常细胞，细胞周期受周期素（cyclin）和周期素依赖性激酶（CDK）的正性调节，在G1期，cyclinD1和CDK4或CDK6结合后，磷酸化灭活pRb，释放转录因子E2F，促进细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖。同时p16INK4A等几个CDK抑制基因对细胞周期进行负调节，其产物p16INK4A蛋白可与cyclin D1竞争结合CDK4或CDK6，并特异性地抑制CDK4活性，使之不能磷酸化pRb，阻止细胞进入S期，从而形成了p16INK4A-cyclinD-CDK4-pRb精细调节级联，在此级联中，pRb-E2F复合物也抑制基因p16INK4A本身的转录。
在HR-HPV感染所致的宫颈癌及癌前病变中，pRb被HPV E7蛋白灭活，阻断了p16INK4A结合CDK4/6降低pRb磷酸化途径，同时减少了pRb-E2F复合物，使p16INK4A失去负反馈抑制，其转录和翻译将相应提高而引起过表达。
p16INK4A过表达和HPV感染与宫颈上皮癌变
宫颈痛前病变的演进与HR-HPV的持续感染有非常强烈的联系。目前多数学者认为：HR-HPV致癌基因E6和E7在宫颈癌及癌前病变细胞中高表达可表现为p16INK4A的过表达。
在宫颈鳞状上皮中，p16INK4A在HR-HPV感染所致癌前病变和癌组织中有高水平表达，而在HPV阴性的宫颈癌和正常组织、细胞中无阳性表达。Kanao等分析25例宫颈鳞癌和11例正常宫颈组织，用RT-PCR和PCR-RFLP法分别检测p16INK4AmRNA和HPV DNA。在25例宫颈鳞癌中，21例HR-HPV阳性，阳性率为84%。在21例HPV阳性的癌组织中，17例p16INK4A mRNA过表达，阳性率为81%。在4例HPV阴性的癌组织中，3例p16INK4AmRNA表达明显减弱，在11例正常宫颈组织中，p16INK4A和HPV均为阴性。由此认为，在HPV所致宫颈癌中，E6和E7致癌蛋白使p53和Rb抑癌基因失活，而导致p16INK4A过表达，但是在HPV阴性的癌组织中，由于p16INK4A的损伤，使p53和Rb功能异常，有助于癌变的发生。而且，Kalof等证实，p16INK4A免疫表达和HR-HPV的检出率随着宫颈鳞状上皮内瘤样变的级别进展而增强、增高。
在宫颈癌中，宫颈腺癌的发病率约占5%～10%，近年有逐年递增的趋势，但是宫颈腺癌及原位腺癌在筛查中常常被漏诊。研究证明，HR-HPV是宫颈腺上皮癌变的主要病因，同时p16INK4A免疫组化染色在HR-HPV阳性的宫颈腺上皮内瘤变、原位腺癌及腺癌中，着色弥漫、均质、强烈，而在正常宫颈腺上皮无表达，因此将HR-HPV检验和p16NK4A免疫染色作为宫颈癌筛查项目将提高宫颈腺癌的检出率。
在罕见的宫颈恶性肿瘤中，也发现p16INK4A过表达和HPV感染。Parwani等取10例宫颈腺基底细 胞癌组织标本，用原位杂交法检测HR-HPV DNA 和免疫组化检测p16INK4A表达。发现所有标本均为HR-HPV阳性和p16INK4A过表达。
p16INK4A检测预测和诊断宫颈癌前病变
由于只有高危性HPV持续感染并整合入宿主细胞基因组才能导致宫颈上皮恶性转化，而一过性的感染并不号引起CIN的发生，因此，HR-HPV阳性对宫颈上皮内高度病变的预测率始终很低。Petry等在德国常规宫颈癌筛查中，随机选取8466例29岁以上妇女，用第二代杂交捕获法（hybrid capture2，HC-2）检测13种高危型HPV，研究HR-HPV感染与宫颈癌的关系，结果证明HR-HPV对宫颈上皮内高度病变的阳性预测值仅为10.9%。但是，细胞内p16INK4A免疫染色阳性意味着HR-HPV DNA整合入宿主细胞基因组，并且导致了细胞的异常转化，因此认为，加人p16INK4A检测将提高对宫颈癌前病变风险的预测率。
目前，液基细胞学（liquid-based Pap test，LBPT）和医生取材HC-2检测HR-HPV相组合，被推荐为最佳宫颈癌筛查方案，已在世界范围内广泛应用。同时一些研究显示，p16INK4A是LBPT中的一个有意义的辅助性标志物，而且比HR-HPV更敏感。Guo等将p16INK4A免疫化学染色和HC-2法检测HR-HPV用于分析210例异常宫颈液基细胞学标本，并同时取宫颈活检组织标本作为对照和诊断标准。结果发现，在液基细胞学标本中，p16INK4A阳性表达在低度鳞状上皮病变（low-grade squamous intraepithelial lesions.LSILs）中为57.9%，在高度鳞状上皮病变（HSILs）中为97.1%，两者比较有明显差异性（P<0.001）；HR-HPV阳性在LSILs为85%，在HSILs86.4%，无统计学差异（P=0.264）。在宫颈细胞学诊断为LSIL的活检组织标本中，对于CIN Ⅱ/Ⅲ的阳性预测率，p16INK4A为33.5%，HR-HPV为21.2%，两者相比差异有统计学意义（P<0.001）。因此认为，在对宫颈上皮内高度病变的预测中，p16INK4A比HR-HPV更有意义，在细胞学诊断为LSIL的患者中，p16INK4A免疫细胞染色可以选择哪些患者需要进一步行阴道镜、活检等检查。
为了减少检测费用，Pientong等4比较了165例传统宫颈巴氏涂片（conventional Pap test.CPT）和LBPT中p16INK4A免疫细胞染色，同时研究p16INK4A过表达和HR-HPV感染的关系。HPV DNA用PCR和斑点杂交技术检测。证明，在CPT中：正常细胞、未确定意义的非典型鳞状细胞（atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS），LSIL，HSIL和鳞状细胞癌（squamous cell carcinomas，SCC），p16INK4A阳性率分别为0，52.5%，54.3%，100%和100%；HPV阳性率分别为10%，45%，57%，70%和86.7%。而且在HR-HPV阳性的HSIL和SCC中，p16INK4A过表达率均为100%。在LBPT中显示了相似的结果，因此认为，在宫颈癌筛查中检测HR-HPV感染所致的异型细胞，传统巴氏涂片联合p16INK4A免疫细胞化学染色更方便实用，符合效价比。
未确定意义的ASCUS是一种不确定的宫颈细胞学诊断结果，其细胞异常程度比反应性细胞改变内病变。该诊断可重复性差，被称为妇科细胞学诊断的灰色地带。其中约20%的ASCUS经组织活检证实为HSIL，甚至宫颈癌。Nieh等选择66例ASCUS同时做p16INK4A的免疫细胞化学染色和阴道镜宫颈活检，以及HC-2检测13种HR-HPV。结果发现，有21例HSIL及以上病变，其中20例p16INK4A强阳性表达；24例LSIL中19例弱阳性表达：21例良性反应性改变中无阳性表达。同时发现，p16INK4A的表达强度与HR-HPV阳性负荷量呈正相关，而且在活检组织病理证实无重要病变的ASCUS细胞学涂片中，p16INK4A表达缺失，但是仍有较高的HR-HPV阳性率。通过对比分析，认为从ASCUS中区分良性反应性改变和LSIL，HSIL，直接可视性的p16INK4A免疫染色比HR-HPV检测更有效。
p16INK4A免疫染色在组织病理和鉴别诊断中的作用
p16INK4A的免疫染色有助于组织病理诊断的一致性。Klaes等随机挑选190例宫颈锥切标本，同时进行HE染色和p16INK4A的免疫组化染色，由5位病理学家独自阅片，在190例病例中，组织病理诊断一致的有130例，其中浸润癌，CINⅢ，Ⅱ和Ⅰ的诊断符合率分别为94%，72%，35%和52%。可以看出对于CINⅠ和CINⅡ诊断结果存在很大分歧。而在190例病例中175例p16INK4A的免疫染色获得一致评价，在各级诊断中符合率均>90%。Dray等用相同方法分析了189例宫颈活检标本，发现p16INK4A阳性表达和病理诊断HSIL的相关性>90%，在对26例组织学诊断和p16INK4A的免疫染色不一致的病例回顾性分析中，最终改变了最初的组织病理学诊断，因此认为，p16INK4A免疫染色可以提高宫颈点活检的病理诊断准确性。Hu等选择161例青少年宫颈活检组织标本（15例宫颈炎，48例CINⅠ，46例CINⅡ，52例CINⅢ），同时进行p16INK4A免疫组织化学染色和HPV DNA检测，结果发现，在HR-HPV阳性的CINⅠ中，p16INK4A免疫染色阳性率为39%，且为分散点状或补丁样染色：在HR-HPV阳性的CINⅡ/Ⅲ组织标本中，p16INK4A免疫染色阳性率为100%，且为弥漫全层染色。由此提示：p16INK4A免疫染色可以区分低、高度CIN，p16INK4A是HR-HPV持续感染的标志物。
p16INK4A免疫染色联合HR-HPV检测有助于原发性宫颈腺癌的鉴别诊断。Elishaev等报道了10例宫颈腺癌转移至卵巢病例，其中5例卵巢肿瘤与宫颈腺癌同时发现，3例于宫颈腺癌后发现，2例先于宫颈腺癌发现。最初，这10例均认为是卵巢原发性腺癌，但在以后的检测中发现，所有病例宫颈和卵巢腺癌组织中均包含相同的HPV类型和p16INK4A的弥漫性表达，因此而明确诊断。在2例未发现宫颈病变的卵巢转移性腺癌中，两者的联合检测发现了隐藏的宫颈腺癌。Ansari-Lari等将p16INK4A和HPV联合检测用于子宫内膜腺癌（特别是子宫下段腺癌）和宫颈腺癌的鉴别诊断，证明p16INK4A比HPV更敏感，操作更容易。Mikami等报道，在宫颈的胃肠道转移性腺癌中，出现p16INK4A频繁表达缺失和HPV阴性，并指出两者有明显相关性，两者均为阴性，提示宫颈肿瘤系转移性癌，而非原发性癌。
p16INK4A检测的应用前景
因为p16INK4A只有在HR-HPV致癌基因整合到细胞基因组，并破坏了G1期调节级联，p16INK4A才会过表达，即p16INK4A的阳性表达意味着细胞已被启动了癌变程序。目前，在宫颈癌筛查中所用的各种细胞学和HR-HPV检测方法都有一定的局限性，而p16INK4A在宫颈上皮高度病变中过表达，并且随着病变加重有一个动态变化的特性，克服了HPV对宫颈上皮高度病变阳性预测率低和细胞学敏感性差、阴性预测率低的缺点。而且其检测方法简单，易于操作，避免了形态学诊断的主观性。因此，p16INK4A和HR-HPV联合检测可提高对宫颈上皮内高度病变的诊断率.
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