《宫颈细胞DNA倍体分析检测宫颈病变的临床价值》——洪琴，罗新
50年来宫颈癌筛查虽然大大减少了发达国家和发达地区宫颈癌的发病率与死亡率，而在发展中国家以及经济欠发达等卫生资源缺乏的地区，宫颈癌的发病率与死亡率虽有所减低，但实际上仍比发达国家高许多。
据世界卫生组织统计的数据，2008年，在发展中国家，宫颈癌的新发病例则位于第二位[28]。2012年，WHO估计世界范围内的宫颈癌新发病例为52.8万，85%发生于经济欠发达地区，中国新增患者6.20万[10]。在这些国家和地区，普遍存在着人口基数大、卫生资源缺乏、病理医生缺乏，尤其是出色的细胞病理学医生，以及经济基础和实力不够的情况，这些情况无疑放大了细胞学检查的不标准性、不确定性、不稳定性。
由于病理医师缺乏以及水平低下，一些地区甚至摒弃细胞学检查，而采用灵敏度较低的宫颈醋酸白染色（VLI）以及宫颈卢戈氏碘染色（VILI）作为宫颈癌的初筛[26,29]。近年来国内外已有报道细胞DNA倍体分析作为新的光电自动检测法来行宫颈癌癌前评价[1，3~6]。宫颈脱落细胞DNA倍体分析较宫颈细胞的TBS分类诊断用于宫颈癌筛查是否有更高或者相当的灵敏度，能否在三阶梯筛查中取代TCT, 实现宫颈癌筛查的自动化、智能化以及标准化是本研究的目的。
1.对象与方法
1.1研究对象
选取2013年2月至2013年10月在夷陵妇幼保健院妇科门诊及住院接受宫颈癌筛查的942例患者，同时进行宫颈细胞DNA倍体分析和TCT检查，其中96例因宫颈细胞DNA倍体分析异常、98例因TCT检查异常、94例因上述两项检查均异常行阴道镜引导下宫颈活检，进行病理组织学检查。108例因功能失调性子宫出血或子宫腺肌病或多发子宫肌瘤行全子宫切除术而获得宫颈病理检查结果，而DNA倍体分析以及TCT检查均未提示异常。这四种情况共396例患者中，年龄最大69岁，最小21岁，平均年龄40.32+8.3岁。
1.2研究方法
1.2.1取材 常规暴露宫颈，用武汉兰丁医学高科技有限公司配套的一次性宫颈细胞采集刷插入宫颈口1-1.5cm，直到采样器的外部刷毛接触到宫颈，以顺时针方向旋转5-10周后慢慢取出，收集宫颈口及宫颈管内脱落细胞，将其放入相应的含有固定液的样本保存管中，下推其刷头入管，拧紧瓶盖。
1.2.2制片、染色 充分振荡样本保存管，以减少宫颈脱落细胞在宫颈采样刷上的黏附，取出宫颈采样刷。将标本由样本保存管移至含有30ml固定液的标本收集管中，加入酶消化液，振荡120min（150次/min），离心5min（800rpm），50%乙醇清洗，离心2次，弃上清液，加固定剂2-3ml，振荡，混匀，加200ul细胞悬液入细胞离心管，离心、甩片5min，制成液基薄层细胞片2张。1张采用巴氏染色做常规细胞学检查，另1张采用Feulgen染色进行DNA倍体分析。
1.2.3检测方法 DNA倍体分析使用LD DNA-ICM系统进行分析，后者由奥林巴斯BX41显微镜、浪潮NP370D2服务器、自动控制平台以及控制系统、ueyeM2240摄像头以及相应的辅助配件组成。在软件方面安装了武汉兰丁医学高科技有限公司自行研制的细胞图像分析软件。操作人员为一般的技术人员。细胞学检查由具有资质的病理医生阅片，采用TBS系统对结果进行分级判断，细胞学结果异常的需经病理主任医师确认。
1.2.4阴道镜检查及病理学检查 凡是宫颈常规细胞学检查结果为未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）及以上，包括ASCUS、低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL）、不排除高级别鳞状上皮内病变的ASCUS （ASC-H）、不典型腺细胞（AGC）、鳞癌、腺癌，均认为细胞学检查结果异常；当细胞DNA值>5时，即可认为是DNA异倍体细胞，DNA倍体分析结果可分为未见DNA异倍体细胞、见少量DNA异倍体细胞（有1~2个异倍体细胞）、 可见DNA异倍体细胞（有3~14个异倍体细胞）、大量DNA异倍体细胞（有异倍体细胞15个及以上）。
凡DNA倍体分析提示有DNA倍体异常细胞，均认为DNA倍体分析检查结果异常。两项检查有一结果异常，则行阴道镜检查并多点活检。部分病例虽然上述检查未提示异常，但是肉眼观察宫颈颗粒样外观、网格状血管走行等情况下，也行阴道镜引导下的宫颈活检。
病理诊断分为无病变组（NILM, 包括慢性宫颈炎伴或不伴鳞状上皮增生、湿疣样改变、乳头状糜烂及息肉样增生等改变）、CINI（包括CINI累腺）、CIN II（包括CINI~II级、CIN II级、以及两者的累腺情况）、CIN III级(包括CIN II ~ III级、CIN III 级、以及两者的累腺情况)、宫颈癌（原位癌、鳞癌、腺癌、腺鳞癌等）。
1.3统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行统计学处理。
2.结果
2.1 DNA倍体分析结果与宫颈活检组织病理学诊断的关系 有一例因上皮细胞过少，DNA无法判读，故行阴道镜引导下宫颈组织活检的396例病例中只有395个DNA倍体的分析报告。35例为CIN II+ 病变，其中28例DNA倍体分析结果提示为异常。结果见表1。
表1 DNA倍体分析与宫颈组织病理结果的比较
Tab 1 Comparison of DNA ploidy analysis and cervical biopsy histopathology
DNA异倍体
细胞数（N）
组织学诊断
合 计
无病变
CINI
CINII
CINIII
宫颈癌
N=0
185
12
3
4
0
0
N=1~2
105
7
4
2
0
118
N=3~14
39
3
6
1
0
49
N=15~
8
1
6
9
0
24
合计
337
23
19
16
0
395
对DNA倍体分析与病理诊断结果做Spearman等级相关的SPSS计算结果显示：相关系数rs=0.374>0，P=0.000<0.01，相关系数rs有统计学意义。即随着dna倍体分析级别的升高，病理诊断异常的可能也有逐渐提高的趋势。见表2及图1。
表2： DNA诊断与病理诊断关系
DNA诊断
病理诊断
DNA诊断
Pearson Correlation
1
.374**
Sig. (2-tailed)
.000
N
395
395
病理诊断
Pearson Correlation
.374**
1
Sig. (2-tailed)
.000
N
395
396
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).
图1：DNA异倍体分析与病理诊断结果为CIN II+ 之间的关系
2.2 TCT结果与宫颈活检组织病理学诊断的关系 因血液成分过多TCT结果无法判读，故396例中只有380个细胞学检查报告。在CIN II+ 病变中，TCT结果异常的有21例。结果见表2。随着TBS诊断级别的升高，病理诊断CIN II+ 的比例总体是不断增加的，但是细胞学检查结果为NILM与ASCUS的患者，其病理诊断CIN II+ 的比例并无明显区别（7.45% VS 6.89%）。见表3，图2。
表3 TCT与宫颈活检组织病理结果的比较
Tab 3 Comparison of TCT and cervical biopsy histopathology
常规细胞学诊断
组织学诊断
合计
NILM
CINI
CINII
CIN III
宫颈癌
正常
166
8
9
5
0
188
ASCUS
150
12
6
6
0
174
LSIL
5
3
0
1
0
9
ASCUS-H
2
0
0
0
0
2
HSIL
1
0
2
4
0
7
AGC
0
0
0
0
0
0
合计
324
23
17
16
0
380
图2：TBS诊断与病理诊断结果为CIN II+ 之间的关系
对TBS诊断与病理诊断结果做Spearman等级相关的SPSS计算结果显示：相关系数rs=0.136>0，P=0.000<0.01，相关系数rs有统计学意义。即随着tbs诊断级别的升高，病理诊断异常的可能也有逐渐提高的趋势。< span=''>
2.3 DNA倍体分析结果与宫颈细胞学检查结果比较 随着细胞学检查结果级别的升高，DNA异倍体细胞的比例也不断升高。在细胞学结果为ASCUS中，有DNA异倍体细胞的比例为46.82%，而在细胞学结果为HSIL中，存在DNA异倍体细胞的比例高达100%。两者的关系见图3。
图3：宫颈细胞学检查与DNA倍体分析结果的关系
分别取细胞学检查结果为ASCUS+为细胞学检查阳性、查见异倍体细胞即为DNA倍体分析阳性，对此两种检测方法做配对卡方检验，McNemar's Test 的结果为：P=0.659>0.05（Excat Sig（2-sided）），两种方法诊断结果差异无统计学意义。
2.4两种宫颈癌筛查方法诊断试验的评价结果 TCT诊断CINⅡ+（宫颈高度病变及宫颈癌）的敏感度为57.6%，准确度为50.8%；DNA倍体分析诊断CINⅡ+的敏感度为80%，准确度为56.9%。详见表4。
表4 3种方案诊断宫颈CINⅡ+的比较
TCT
DNA倍体分析
TCT+DNA倍体分析
敏感度（%）
57.6
80
81.3
特异度（%）
50.1
54.7
26.8
准确度（%）
50.8
56.9
31.4
阳性预测值（%）
9.9
14.7
9.3
阴性预测值（%）
92.6
96.6
93.9
约登指数
0.08
0.35
0.08
阳性似然比
1.15
1.77
1.11
阴性似然比
0.85
0.37
0.7
图4：DNA倍体分析与细胞学检查以及两者联合诊断CINⅡ+病变的ROC曲线
图4为DNA倍体分析、细胞学TBS诊断以及两种方法联合诊断CINⅡ+病变的ROC曲线，三者的曲线下面积分别为0.769、0.580、0.732结果提示，DNA倍体分析诊断CINⅡ+病变优于单独细胞学TBS诊断以及两种的联合应用。
3.讨 论
细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA含量或倍体的测定来判断细胞的生理状态和病理改变。目前主要是使用全自动DNA图像分析系统（DNA-ICM）。定量分析细胞DNA具有如下特点[30]：
①检测细胞核内的相对DNA含量，而不是绝对值。常用c（content）作为单位来衡量DNA的含量。1个c为正常G0/G1细胞DNA含量的一半。
②Feulgen染色使DNA特异性着色。其染色的深浅与DNA的含量成正比。
③通过测量光密度（灰阶）计算被测细胞细胞核的积分光密度值(IOD, integrated optical density)。
④用DNA指数来表示DNA含量。DNA指数=被测细胞DNA IOD值/正常细胞DNA IOD平均值。
⑤由于淋巴细胞内DNA含量及形态较为稳定，细胞DNA倍体分析时常用同一标本的淋巴细胞作为标准对照。
⑥分析每个细胞的DNA含量，并用DNA直方图，散点图显示标本恶性度。按细胞DNA含量高低，由高到低自动排序，将核酸含量高的前20个细胞核酸含量值直接报告，高于正常值为癌变细胞。（如图5）。
图5：细胞DNA倍体分析报告图
宫颈细胞的恶变由胞核染色质首先改变，高危型HPV的DNA整合到宫颈细胞核DNA上，病毒蛋白E6/E7分别通过与抑癌蛋白P53、RB相作用，干扰中心体合成，纺锤丝缺陷，出现异倍体细胞核，最终才发展到晚期癌变细胞。这是细胞DNA定量分析技术可用于宫颈癌筛查的理论依据，也是全自动DNA图像分析系统在诊断CIN病变有可能较常规细胞学敏感的理论基础。
1924年Feulgen和Rossenbcek发现了细胞核内DNA染色技术后[25]，使得这一理论转为实际应用。这一技术才得以开展、应用于实验室及临床。早在2004年，The European
Society of the Analytical Cellular Pathology 就对DNA倍体分析适用于辅助诊断宫颈病变达成共识[11]。近十多年，不断有DNA倍体分析技术用于临床的报到[2,5,12-15,19],在妇产科，多限于对宫颈癌及癌前病变的DNA倍体分析[1,7,8,18,22]，而用于宫颈癌普查则报道的较少[3,6,21]。
本研究结果显示，随着细胞学检查结果级别的升高，DNA异倍体细胞的比例也不断升高，与Nguyen VQ 等[8]研究结果相似，同时，随着DNA倍体分析级别的升高，病理诊断异常的可能也有逐渐提高的趋势。此外，相对于单项筛查，宫颈细胞DNA倍体分析检测出CINⅡ+病变的敏感性要高于细胞学的TBS诊断（80% VS 57.6%）,两者的特异度差别不大（54.7% VS 50.1%）。就筛查方案而言，DNA倍体分析诊断CINⅡ+病变优于单独细胞学TBS诊断以及两种的联合应用。
当然，宫颈细胞DNA倍体分析也有其不足之处[30]。目前宫颈癌的趋势之一腺癌的比例，而腺癌细胞比起鳞癌细胞，更容易重叠，聚集成团，造成一定程度的分割困难，DNA图像分析系统极易将这类细胞视为垃圾细胞，不能做出诊断，增加了误诊和漏诊率。此外，维生素B12缺乏、放疗、化疗、HPV病毒感染等因素均可能影响DNA含量的测定，目前实际所测得的数据并不能将这些影响因素加以区分。
虽然现已明确，高危型HPV感染是95%以上宫颈癌的明确病因，但是HPV感染不能机械地等同于肿瘤进展，在妇女一生中高达80%的人会感染HPV, 其中90%的HPV DNA 可在2年后转阴，这是HPV感染最常见的结局。只有不到10%的感染会持续存在，但这其中也只有少部分高危型HPV持续感染可能引发宫颈病变或者宫颈癌。
这也是不提倡单独将高危型HPV检测作为宫颈癌筛查的主要原因。美国癌症协会、美国阴道镜和宫颈病理学会（ASCCP），和美国临床病理学会（ASCP）新近更新的宫颈癌筛查的联合指南强调的是细胞学的筛查或者是细胞学联合高危型的HPV筛查。新近的研究也支持联合筛查[17.20.23],虽然液基细胞学检查为目前主流的细胞学筛查方法，但不同国家、地区因经济情况、细胞病理医师水平、工作量不对等原因，无法彻底改变液基细胞学检查不标准性、不确定性、不稳定性的“三不”缺憾。
DNA倍体分析也是针对宫颈细胞的检测，且核酸的改变早于细胞形态学的改变，这也是DNA倍体分析敏感度较液基细胞学检查高的可能原因。此外，相较于TCT，DNA倍体分析自动化程度高、更经济实用。在部分文献中[20.3.21]，推荐将DNA倍体分析或者DNA倍体分析联合高危型HPV检测作为宫颈癌的一线筛查。本研究的结果也支持DNA倍体分析用于宫颈癌的一线筛查。
在今后的研究中， 将进一步比较此两者种针对宫颈细胞的检查联合针对宫颈癌病因的高危型HPV检查各种筛查方案的优劣。
