抗艾滋病毒中草药的快速筛选

马瑜

【摘要】：目的：艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）是由人类免疫缺陷病毒(HIV)所引起的[1]。HIV以人体免疫系统的中枢细胞—T4淋巴细胞为攻击目标，使患者的免疫系统失衡，免疫功能低下，进而使人体成为各种疾病的载体，极易感染各种并发症或肿瘤最终死亡。艾滋病在世界范围内的疯狂流行及高死亡率，严重威胁着人类的健康及社会的发展。目前常用的治疗艾滋病的药物主要是蛋白酶抑制剂类药物和逆转录酶抑制剂类药物。这些药物成本高、副作用大、易引起各种并发症，并且无法兼顾对抗艾滋病毒及患者的免疫系统[2]。同时由于HIV-1在遭受药物攻击以后，其DNA在复制的过程中会发生基因突变，使得HIV-1病毒产生相应的抗体，从而使病人产生耐药性。由于艾滋病人死亡的主要原因是患者的免疫系统被破坏，患者遭受各种机遇性感染而死亡，而中医是从整体观点进行辨证施治对症下药，以提高机体的免疫力为目的。而且中药副作用小，不会引起各种并发症，同时来源广泛，价格低廉，因而避免了西医治疗价格昂贵、毒性大、耐药性等缺点，其开发前景可观。随着治疗艾滋病的新靶点——P-TEFb的发现，一旦我们得到了可以竞争性结合CyclinT1，有效阻止CyclinT1与Tat结合的药物，抑制P-TEFb的活性，进而阻断艾滋病毒基因组的复制，便可以保证该种药物对HIV-1的攻击长期有效，也就可以克服抗艾药物耐药性的问题[3]。 鉴于此，本论文构建出真核生物表达载体，利用酿酒酵母这一模式生物，运用酵母双杂交技术，依赖治疗艾滋病的新靶点——P-TEFb，快速筛出可阻止CyclinT1与Tat互作，从而抑制p-TEFb的活性的中草药，为其进入临床治疗使用打下坚实的基础。 方法：通过将目的基因CyclinT1和Tat分别连接入载体质粒pGBKT7和pGADT7-ReC上，构建出真核表达载体pGBKT7-CyclinT1和pGADT7-ReC-Tat；将真核表达载体分别转入酿酒酵母中，运用酵母双杂交技术，对中草药进行筛选；依据抗艾新靶点P-TEFb的特性，筛选出能够抑制Cyclint1和Tat互作，从而抑制P-TEFb的活性，阻断艾滋病毒基因组复制的有效中草药，达到快速筛选抗艾药物的目的。 结果：1、本研究通过PCR扩增出正确的目的基因片段Cyclint1和Tat，运用分子生物学方法成功构建出真核生物表达载体pGBKT7-CyclinT1和pGADT7-ReC-Tat； 2、成功将真核生物表达载体pGBKT7-CyclinT1和pGADT7-ReC-Tat转入酿酒酵母AH109菌株中，经验证，二者确实相互作用，成功构建出酵母双杂交系统； 3、运用酵母双杂交技术，分别对供试的20种中草药进行筛选，成功筛选出了抑制Cyclint1和Tat相互作用的中草药：商陆、黄芩、黄柏、紫河车（特定浓度下）。

【关键词】：酿酒酵母 酵母双杂交 艾滋病 中草药快速筛选

【学位授予单位】：河南师范大学

【学位级别】：硕士

【学位授予年份】：2012

【分类号】：R284

【目录】：摘要4-6

ABSTRACT6-8

目录8-11

缩略语11-12

第一章 前言12-28

1.1 酿酒酵母简介12-16

1.1.1 酿酒酵母概述12-13

1.1.2 酿酒酵母的目前应用情况13

1.1.3 酿酒酵母基因表达系统13-16

1.2 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）16-21

1.2.1 酵母双杂交的发展16

1.2.2 酵母双杂交的原理16-17

1.2.3 酵母双杂交的应用17-19

1.2.4 酵母双杂交的优点和不足19-21

1.3 艾滋病的研究进展21-25

1.3.1 艾滋病简介21-23

1.3.2 目前常用的抗艾方法23-24

1.3.3 治疗艾滋病的新靶点－P-TEFb24-25

1.4 中药治疗艾滋病25-27

1.4.1 中药简介25-26

1.4.2 中药治疗艾滋病的现状26

1.4.3 抗艾中草药的快速筛选---酿酒酵母是理想模式生物26-27

1.5 本论文的目的和意义27-28

第二章 材料与方法28-38

2.1 试验材料28

2.2 试剂及培养基28-31

2.3 酶和试剂盒31

2.4 主要实验仪器31-32

2.5 实验方法32-38

2.5.1 提取含有载体的质粒32

2.5.2 扩增目的基因32-33

2.5.3 琼脂糖凝胶电泳33

2.5.4 目的片段的回收33

2.5.5 与质粒载体 pGADT7-ReC 及 pGBKT7 相连接33-34

2.5.6 制备大肠杆菌感受态细胞并转化34

2.5.7 载体的鉴定34-35

2.5.8 转入酵母35-36

2.5.9 “诱饵”质粒和“猎物”质粒的自激活36

2.5.10 诱饵蛋白在酵母中毒性作用的检测36

2.5.11 酵母双杂交鉴定36

2.5.12 抗艾滋病毒中草药的筛选36-38

第三章 结果与分析38-48

3.1 真核表达载体的构建38-42

3.1.1 目的基因片段的扩增38-39

3.1.2 载体的获得与鉴定39

3.1.3 真核表达载体的构建及鉴定39-40

3.1.4 “诱饵”质粒和“猎物”质粒的自激活检测40-41

3.1.5 诱饵蛋白在酵母中毒性作用的检测41-42

3.1.6 “诱饵”质粒和“猎物”质粒转化株的检测42

3.2 抗艾滋病毒中草药的筛选42-48

第四章 讨论48-54

4.1 实验方法的选择和依据48-49

4.1.1 选材依据48

4.1.2 酵母双杂交与抗艾新靶点48-49

4.1.3 中草药与艾滋病的治疗49

4.2 抗艾滋病毒中草药的筛选49-52

4.3 探究与思考52-54

结论54-56

参考文献56-66

致谢66-67

攻读学位期间发表的学术论文目录67-68