- 龟板活性成分调控Shh/Wnt3a信号通路诱导骨髓间充质干细胞成骨分化
- 简介:
- 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有向成骨分化的潜能,在骨缺损修复领域具有广阔的应用前景。以中医学“肾主发育,主骨生髓”为理论依据,前期的研究表明,益肾中药龟板通过调控视黄酸受体α(RARα)与维生素D受体(VDR)两条信号通路而影响MSCs的增值和分化。本研究立足前期建立的龟板甾类成分的分离分析、质控及MSCs的成骨分化技术,免疫组化、Western blot、原位杂交、RT-PCR等方法检测成骨分化标志物ALP、OPN及VDR的表达,证实维生素D受体是龟板提取物诱导MSCs成骨分化的可能药理靶点;进一步结合计算机辅助药物设计,用分子对接的方法模拟龟板提取物中三个甾类成分(4-甾酮、十四酸甾醇酯、甾醇)与核受体VDR的相互亲和力,同时采用活性导向的标准组分模式来验证龟板中何种甾类成分是诱导MSCs成骨分化的物质基础,并用Shh信号通路的特异性抑制剂环杷(Cyclopamine)阻断Shh信号通路,探讨了引发这一生物学效应的信号通路机制。计算机模拟结果表明,4-甾酮对核受体VDR的亲和力较十四酸甾醇酯大,而后者又比甾醇大。实验结果表明,龟板活性成分4-甾酮能显著增加其钙化结节的数目,提高成骨分化标志物ALP、OPN的表达水平,并且以剂量依赖的方式促进Shh 及Wnt3a的表达,表明4-甾酮是龟板提取物诱导MSCs成骨分化的物质基础,其成骨分化的机制可能与上调信号分子Shh 及Wnt3a的表达有关。计算机模拟结果和实验结果相一致,具有可重复性。在此基础上,用Cyclopamine阻断Shh信号通路后检测发现Gli1不表达,Wnt3a略见表达,而VDR的表达组间未见明显改变,推测其成骨分化的可能机制与龟板活性小分子直接进入细胞膜作用核受体VDR,进而上调Shh的表达,激活其下游转录因子Gli1及Wnt3a信号,最终启动成骨分化有关。
- 详细介绍:
- 1 研究内容1.1 探讨龟板提取物诱导MSCs成骨分化的可能维生素D受体机制,证明VDR是龟板提取物诱导MSCs成骨分化分子药理靶点。1.2 探讨龟板提取物中诱导MSCs成骨分化的甾类物质基础,分子对接法分析龟板中三种甾类成分与核受体VDR的亲和力。1.3 利用体外MSCs成骨分化模型,采用活性导向的标准组分模式来探讨龟板提取物中何种甾类成分能诱导MSCs成骨分化,明确龟板中何种甾类成分是发挥该药效的活性成分。1.4 利用已筛选出的甾类活性成分,作用体外MSCs成骨分化模型,分析Shh、Wnt3a的表达情况,揭示这两个信号分子在MSCs成骨分化过程中可能参与的作用。1.5 利用体外MSCs成骨分化模型,用Shh信号通路的特异性阻断剂cyclopamine阻断该通路,并检测信号分子Gli1、Wnt3a、VDR的表达情况,揭示龟板诱导MSCs成骨分化的Shh/Wnt3a信号通路机制。2 拟解决的关键问题2.1 龟板中何种甾类成分具有诱导MSCs成骨分化的活性作用。2.2 龟板中活性甾类成分与Shh/Wnt3a信号通路之间的关系3 该实验分五个阶段进行:3.1 第一阶段:龟板提取物诱导MSCs成骨分化的可能维生素D受体的机制3.1.1 龟板的鉴定、提取及质控 龟板产地为海南省海口市,由广东省汕头市药材采购供应站提供,并经广州中医药大学中药学院鉴定。将龟板低温粉碎成粗粉,用递增极性溶剂石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水分分步提取龟板,得到具有促进MSCs增殖分化作用的乙酸乙酯部位。该部位由甾类,脂肪酸及其酯组成,其中甾类成分包括4-甾酮、十四酸甾醇酯和甾醇。用GS-MS和HPLC严格质控,该研究已获得一项中药发明专利(专利号:ZL 200610034579.9)及省成果。本实验用4-甾酮(S1)、十四酸甾醇酯(S2)、甾醇(S3)三个标准品(均购自TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. TOKYO , JAPAN.TCI)模拟进行体外实验,均不溶于水,二甲基亚砜溶解后配置成不同浓度的溶液备用。3.1.2 MSCs的分离培养 将大鼠股骨、胫骨骨髓用L-DMEM冲出,充分混匀,转入离心管,300g离心10min,去上清,D-Hanks重悬,离心去上清后,加4ml D-Hanks混匀。Percoll分离液按0.56:0.44混合,取4ml放入10ml离心管内,吸骨髓液在离液面2cm处贴管壁缓缓加入。水平离心机900g离心30min,收集单核细胞层,用DMEM洗涤两次。然后计数细胞,调整密度,按1?106/cm2密度接种,37℃,5%饱和湿度的CO2 孵箱培养,培养液为含10?S的L-DMEM,3天后更换培养液,弃去未贴壁细胞,2-3天换液1次,接近融合的MSCs用含0.25%胰酶室温消化2-3min,按1?104/cm2传代,传至第3代得到1?107/cm2个细胞。3.3.3 MSCs的成骨诱导培养 条件培养基(Osteo-induced)和龟板提取物分别作用于第3代MSCs,对照组(Control)不加任何处理因素。Control组培养液为含10?S、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的L-DMEM;Osteo-induced组在Control组基础上加入50μg/ml维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松;S1、S2、S3组在Control组基础上分别加入龟板提取物30mg/ml;各组以1?105/cm2细胞密度接种入预先放置玻片的24孔培养板,待细胞贴壁后,按组加入处理因素,复孔,每3天换液1次。7天后行成骨标记物ALP、OPN的免疫组织化学染色及原位杂交。另以1?105/cm2细胞密度接种入6孔培养板,待细胞贴壁后,按组加入处理因素,复孔,每3天换液1次。7天后提取细胞蛋白行成骨标记物ALP、OPN的Western blot检测。 3.3.4原位杂交检测VDR 24孔板培养3天后细胞爬片,4%多聚甲醛(含DEPC)固定30min,新鲜配置3%过氧化氢-甲醇溶液避光10min, 3%的枸橼酸1ml 胃蛋白酶2滴消化10min,预杂交液38℃于20%的甘油湿盒内孵育3h,杂交液38℃孵育过夜;生物素化羊抗地高辛37℃孵育1h,SABC-POD37℃孵育30min,生物素化过氧化物酶37℃孵育30min。DAB显色约10min,时间可根据显色情况掌握。水洗,脱水封片。阴性对照分别用不含探针的杂交缓冲液取代含探针的杂交液,及用正常羊血清取代羊抗地高辛抗体IgG进行孵育。每组2张玻片,2次独立实验。每张片随机选取5个不重复的200倍视野,计算阳性细胞百分比(阳性细胞百分比=阳性细胞数/总细胞数),并与Control组及Osteo-induced组进行比较。3.3.5 免疫组织化学染色 24孔板处理7天后终止培养,取出盖玻片,PBS漂洗,4%多聚甲醛固定,3%过氧化氢封闭5-10min,滴加羊血清,室温封闭30min弃去,分别加入(稀释度1:400)一抗工作液(ALP、OPN),4℃过夜,0.01M PH 7.2的PBS洗涤液洗涤,再加二抗,即生物素化羊抗兔IgG(稀释度1:500)室温下孵育30 min,DBA显色,苏木素复染,中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗,实验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。光镜下观察、拍照,判定各组ALP、OPN染色的阳性结果(阳性细胞被染成棕黄色)。每组2张玻片,2次独立实验。每张片随机选取5个不重复的200倍视野,计算阳性细胞百分比(阳性细胞百分比=阳性细胞数/总细胞数),并与Control组及Osteo-induced组进行比较。3.3.6 Western blot 法检测 6孔板处理7天后终止培养,称重,按其重量加入适量蛋白裂解液(RIPA)及蛋白酶抑制剂(PMSF),高速低温离心(12000?10min),提取细胞蛋白。取蛋白样品20μl,加20μl(2?buffer)上样缓冲液,100℃煮3min,离心5min,各取20μl上样,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶5%,分离胶10%,于80-100V进行电泳80min。完整将分离胶取下,于转移缓冲液静置30min后,转移夹靠PVDF膜,排除气泡,以31mA转移60min。取出PVDF膜,TTBS洗5min3次,5%脱脂牛奶封闭30 min,加兔抗大鼠的多克隆抗体ALP、OPN(1:500稀释),即一抗,4℃过液,次日用TTBS洗PVDF膜3次,然后加1:5000二抗(羊抗兔IgG-HRP),室温反应1h。用TTBS洗10min 3次,加超敏发光液反应5min,排去液体,用保鲜膜包裹,用X光片在增感屏中紧密接触,使X光片感光10min,显影,定影,冲洗,晾干,用Uniscan A686扫描系统将条带扫描入电脑。每组2张片,2次独立实验。3.3.7 RT-PCR检测VDR 提取空白组、成骨诱导组、龟板组三组的基因组,总RNA按照Trizol试剂盒说明书进行;RT-PCR参照Genbank的cDNA序列,采用Primer Premier5.0软件设计引物,由上海英骏公司合成。VDR上游引物:5-GGAACGTGCCCCGAATCTGC-3,下游引物:3-CACCCCCATCTCCACGAACTG-5,反应条件为:93℃ 2 min,然后93℃ 45seconds,63℃ 30secends,共30个循环。反应结束后,取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。VDR和GAPDH反应条件相同。RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,以图像分析仪进行吸光度扫描。3.3.8 统计学分析 实验数据均以(X?S)表示。应用SPSS13.0医用统计软件包进行数据统计学处理,组间比较用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义3.2 第二阶段:分子对接模拟龟板中三个甾类成分与靶标蛋白的关系 采用计算机辅助药物设计,用分子对接的方法模拟了龟板提取物中三个甾类成分(4-甾酮、十四酸甾醇酯、甾醇)与VDR、Shh及Wnt3a等靶标蛋白之间的相互作用。(见分子对接虚拟筛选流程图)3.3 第三阶段:龟板中诱导MSCs成骨分化甾类活性成分的筛选3.3.1 龟板的鉴定、提取及质控具体方法同上3.3.2 MSCs的分离培养具体方法同上3.3.3 MSCs的成骨诱导培养 条件培养基(Osteo-induced)和龟板甾类成分4-甾酮(S1)、十四酸甾醇酯(S2)、甾醇(S3)分别作用于第3代MSCs,对照组(Control)不加任何处理因素。Control组培养液为含10?S、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的L-DMEM;Osteo-induced组在Control组基础上加入50μg/ml维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松;S1、S2、S3组在Control组基础上分别加入S1、S2、S3各15?0?8g/ml;各组以1?105/cm2细胞密度接种入预先放置玻片的24孔培养板,待细胞贴壁后,按组加入处理因素,复孔,每3天换液1次。7天后行成骨标记物ALP、OPN的免疫组织化学染色。另以1?105/cm2细胞密度接种入6孔培养板,待细胞贴壁后,按组加入处理因素,复孔,每3天换液1次。7天后提取细胞蛋白行成骨标记物ALP、OPN的Western blot检测 3.3.4 钙化结节Von Kossa染色 诱导7天后进行钙化结节Von Kossa染色,确定细胞外基质的矿物化。用无Ca2 、Mg2 双蒸水洗细胞3次,多聚甲醛室温固定4h后,用新鲜配置的5%硝酸银水溶液浸泡并在紫外线下照射1h;双蒸水洗涤后,用5%硫代硫酸钠水溶液反应2~3min,以除去多余的银,蒸馏水再次洗涤。0.2%核固红水溶液中和染色2min,蒸馏水洗涤,常规脱水、透明、封片,倒置显微镜下观察并拍照,计数。3.3.5 钙化结节茜素红染色 诱导7天后进行钙化结节茜素红染色,确定细胞外基质的矿物化。培养皿用无Ca2 、Mg2 PBS冲洗2次,95%乙醇固定10min,无Ca2 、Mg2 双蒸水冲洗3次;0.1%茜素红-Tris-Hcl(PH 8.3)37℃,30min; 蒸馏水洗涤,常规脱水、透明、封片,倒置显微镜下观察并拍照,计数。3.3.6 免疫组织化学染色 24孔板处理7天后终止培养,取出盖玻片,PBS漂洗,4%多聚甲醛固定,3%过氧化氢封闭5-10min,滴加羊血清,室温封闭30min弃去,分别加入(稀释度1:400)一抗工作液(ALP、OPN),4℃过夜,0.01M PH 7.2的PBS洗涤液洗涤,再加二抗,即生物素化羊抗兔IgG(稀释度1:500)室温下孵育30 min,DBA显色,苏木素复染,中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗,实验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。光镜下观察、拍照,判定各组ALP、OPN染色的阳性结果(阳性细胞被染成棕黄色)。每组2张玻片,2次独立实验。每张片随机选取5个不重复的200倍视野,计算阳性细胞百分比(阳性细胞百分比=阳性细胞数/总细胞数),并与Control组及Osteo-induced组进行比较。3.3.7 Western blot 法检测 6 孔板处理7天后终止培养,称重,按其重量加入适量蛋白裂解液(RIPA)及蛋白酶抑制剂(PMSF),高速低温离心(12000?10min),提取细胞蛋白。取蛋白样品20μl,加20μl(2?buffer)上样缓冲液,100℃煮3min,离心5min,各取20μl上样,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶5%,分离胶10%,于80-100V进行电泳80min。完整将分离胶取下,于转移缓冲液静置30min后,转移夹靠PVDF膜,排除气泡,以31mA转移60min。取出PVDF膜,TTBS洗5min3次,5%脱脂牛奶封闭30 min,加兔抗大鼠的多克隆抗体ALP、OPN(1:500稀释),即一抗,4℃过液,次日用TTBS洗PVDF膜3次,然后加1:5000二抗(羊抗兔IgG-HRP),室温反应1h。用TTBS洗10min 3次,加超敏发光液反应5min,排去液体,用保鲜膜包裹,用X光片在增感屏中紧密接触,使X光片感光10min,显影,定影,冲洗,晾干,用Uniscan A686扫描系统将条带扫描入电脑。用Quantity One 软件对图像进行半定量分析,以目的条带与内参β-actin条带的光密度比值来表示蛋白含量的相对值。每组2张片,2次独立实验。3.3.8 统计学分析 实验数据均以(X?S)表示。应用SPSS13.0医用统计软件包进行数据统计学处理,组间比较用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。3.3.9 确定甾类活性成分 用阳性细胞计数的方法定量两种染色方法所得的钙化结节数及ALP、OPN免疫组化的结果,用Quantity One 软件对ALP、OPN Western Blot的条带进行半定量分析,统计学分析,确定龟板中能诱导MSCs成骨分化的甾类活性成分。 3.4 第四阶段:Shh及Wnt3a信号分子在龟板甾类活性成分诱导MSCs成骨分化中的作用3.4.1龟板的鉴定、提取及质控具体方法同上3.4.2 MSCs的分离培养具体方法同上3.4.3 MSCs的成骨诱导培养 在设立对照组(Control)的前提下,将甾类活性成分以不同剂量(3?0?8g/ml、30?0?8g/ml)分别作用于第3代MSCs,Control组培养液为含10?S、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的L-DMEM;Osteo- induced组在Control组基础上加入50μg/ml维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松;其他组在Control组基础上分别加入不同剂量(3?0?8g/ml、30?0?8g/ml)的甾类活性成分。各组以1?105/cm2细胞密度接种入预先放置玻片的24孔培养板,待细胞贴壁后,按组加入处理因素,复孔,每3天换液1次。7天后行Shh、Wnt3a的免疫组织化学染色及Western blot检测。3.4.4 免疫组织化学染色 一抗为兔抗多克隆抗体Shh、Wnt3a,具体方法同上。3.4.5 Western blot 法检测 一抗为兔抗多克隆抗体Shh(1:500稀释)或Wnt3a(1:1000稀释),具体方法同上。3.4.6 统计学分析 具体方法同上3.5 第五阶段:Shh/Wnt3a信号通路在龟板活性成分诱导MSCs成骨分化中的作用3.4.1龟板的鉴定、提取及质控具体方法同上3.4.2 MSCs的分离培养具体方法同上3.4.3 MSCs的成骨诱导培养 分为4组,在设立对照组(Control)的前提下,将甾类活性成分以3?0?8g/ml作用于第3代MSCs,Control组培养液为含10?S、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的L-DMEM;另外两组分别为:在Control组基础上加入3?0?8g/ml的甾类活性成分及500nmol/L的cyclopamine;单独500nmol/L的cyclopamine。各组以1?105/cm2细胞密度接种入预先放置玻片的24孔培养板,待细胞贴壁后,按组加入处理因素,复孔,每3天换液1次。7天后行Shh、Wnt3a、VDR、Gli1的免疫组织化学染色及Western blot检测。3.4.4 免疫组织化学染色 一抗为兔抗多克隆抗体Shh、Wnt3a、VDR、Gli1,具体方法同上。3.4.5 Western blot 法检测 一抗为兔抗多克隆抗体Shh、VDR、Gli1(1:500稀释)或Wnt3a(1:1000稀释),具体方法同上。3.4.6 统计学分析 具体方法同上