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学习时间丨测序技术简介及对比——二代测序
火炎森林
>《NGS》
2022.03.16
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▍内容参考/优医智库
▍
作者/学者 方海英
导 读
二代测序技术由于其解决了原有测序技术的弱点,一跃而上成为了基因测序应用的新宠。其最大特点在于,测序通量达到了数量级的提高;得益于其通量提升,测序的边际成本显著下降,因此,以人类基因组为代表,对大量基因进行序列的测序成本也产生了指数下降的成果。
了解你手中的工具,是迈向成功必不可少的环节。在基因检测上,了解测序相关的技术及其特点,并在合适的情境下运用合适的技术,是在保证检测有效性的前提下将总体成本最优化的必备技能之一。
图 1测序技术发展历程与技术比较
[1]
前面的两期已经对一代测序技术之中的qPCR以及桑格测序做了初步介绍。两者虽然足够满足基本的分子病理学检测或基因测序需求,但是对于多基因的综合测序分析就开始力不从心;并且如果规模进一步扩大,成本与时间的指数增长就成为了一代测序的阿喀琉斯之踵。
根据美国国立卫生研究院(NIH)国家人类基因组研究院(NHGRI)的数据,人类全基因组测序计划于1990年立项,耗时13年才得以初步完成,耗资达到27亿美元
[2]
。在该项计划初步完成之后,如何缩短测序所需时间,降低测序成本,就成了一个重要的发展方向。在NHGRI发起的降低测序成本的计划刺激下,发展出了一系列的二代测序技术(NGS)。
图 2每百万碱基DNA序列测序成本演变
[3]
对于大规模的基因组测序来说,2011年时间点上,桑格测序法的平均成本为每百万碱基约500美元,而二代测序已经将平均测序成本压到了每百万碱基0.5美元以下
[4]
。目前,二代测序技术已经将人类基因组测序成本压到了1000美元,上机测序时间48小时以下
[5]
。
二代测序技术相比于一代测序而言,总体上有数个共通的,大的改进。首先,比起一代测序主流上通过细菌质粒克隆的方法对DNA碎片进行前期克隆处理,二代测序普遍使用了无细胞系统进行NGS建库的前期准备;这样可以排除质粒中克隆载体序列的干扰
[6]
。
图 3常见二代测序技术解决方案流程说明
[7]
其次,相比起一代测序最多上百的并行测序量,二代测序技术的并行测序量产生了数个数量级的提升;在NGS中,并行度能从数千直至数百万。再次,测序结果的读取不用经过电泳过程,而是在碱基合成或类似过程中直接测序;该过程可以在循环且大批量的过程下进行
[6]
。上述两点对二代测序技术的通量提升做出了极大的贡献。
NGS技术的具体实现方式有许多差异,例如最早的NGS,由现属于罗氏旗下的454生命科学所推出基于乳化PCR 焦磷酸测序法的NGS;以及现今行业中流砥柱,对NGS技术发展与测序成本降低的推动做出关键技术贡献的Illumina所推出的基于桥式PCR扩增 荧光染色可逆终止物的NGS;抑或是测序行业另一巨头Thermo Fisher旗下Life Technologies所提供的NGS解决方案,均是达成同一目标的不同策略
[8]
。
Illumina测序方案原理解说
在二代测序的技术及解决方案之中,不得不提到一家企业,就是国内的华大基因。华大基因的二代测序方案来源自Complete Genomics与2009年提出的技术概念
[9]
。2013年Complete Genomics被华大基因收购,华大基因对其成果进行了进一步的改良与优化,于2015年推出了自己的BGISEQ-500平台
[10]
,从此也作为参与者进入了二代测序的大舞台。虽然是后来者,表现却相当出色:其MGISEQ-2000平台能在成本远低于Illumina HiSeq 4000的情况下产出一致性相当高的测序结果
[11]
。因此也是备受青睐。
二代测序从此设计上就是参照先前测序手段的短板,无论是潜在干扰的排除还是总的测序通量,均进行了针对性的优化与改进,但这并不代表二代测序技术是完美无缺的。比起一代测序,二代测序的读长普遍较短,因此其测序结果需要使用专门的工具进行处理,并且在测量具有重复序列的基因时可能存在偏差
[12]
。
目前针对这一问题,主要是通过桑格测序法对二代测序进行验证来确保结果有效。而为了解决这一问题,开发出的单分子测序技术,即三代测序,在保证高通量的同时达到了长读长,并且无需前期PCR扩增即可进行测序
[13]
;三代测序目前仍在完善之中,因此目前技术上最好的选择仍然是二代测序的解决方案。
图 4一代测序与二代测序在成本有效性上的对比
[14]
除去技术因素,进行二代测序的仪器与分析软件等的购置,即固定成本,相比一代测序的各类技术,仍然相对高昂。但是当测序量增长时,其边际成本上升相对较慢,因此在测量大量基因序列时,二代测序才开始体现成本优势。
综上,二代测序可以满足目前诊断医学上的绝大多数需求,尤其是多基因测序,全外显子测序,全基因组测序等综合性应用上,二代测序的价值是无法替代的。
表 1常见基因检测技术对比
参考文献:
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