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苏云金杆菌漫谈

近年来随着生物农药的大热,微生物杀虫剂作为热门话题反复被提及。而苏云金杆菌的销量占据整个生物杀虫剂中占95%,是微生物杀虫剂中绝对的'王者’。但也由于其为生物,需要保证菌株存活才能保证杀虫效率,故其相对应制剂和复配剂型的研发大大受限。

何为苏云金芽孢杆菌?

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)是一种微生物杀虫剂,对人、畜及害虫天敌极少或完全没有毒害作用,不污染环境,保持生态平衡,在农业、林业、卫生害虫的生物防治中占有重要地位。

苏云金芽孢杆菌是土壤细菌

苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性、杆状、能形成内生芽孢的土壤细菌,其营养体细胞具有周生鞭毛或无鞭毛。鞭毛是细菌的一种运动器官,因此,具有鞭毛的菌株能运动,而不具鞭毛的菌株不能运动,在形成芽孢的同时,在细胞的另一端形成不同形态、具蛋白性质的伴孢晶体,它可以是一个、两个或多个。

苏云金芽孢杆菌分类上属于原核生物界,细菌纲,芽孢杆菌科(Bacillaceae),芽孢杆菌属(Bacillus)的一种,在《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版中被列为第二类第十八群。苏云金芽孢杆菌广泛分布于世界各地,从热带雨林到北极冻土带,从土壤、昆虫尸体、植物体表面、贮藏物或仓库灰尘、污水等基质上均可分离到该菌,而土壤为微生物的大本营,是其分布最为丰富的生境。据估计,目前世界上约有60,000余个苏云金芽孢杆菌分离物。

发现

 早在1901年,一个叫做石渡的日本细菌学家就在患病的家蚕幼虫上得到了一种杆状芽孢菌,并在1905年发表的另一报告中称之为“碎倒芽孢杆菌”。

后来在1911年的德国,一个叫苏云金的小城镇上 ,一种叫地中海粉螟的仓储害虫危害频繁, 仓库里成虫飞舞, 面粉中幼虫大快朵颐。直到一只离奇死亡的粉螟幼虫引起了生物学家贝尔内(Berliner)的注意,随后他从这些患病的地中海粉螟幼虫体内分离到另一株类似的细菌之后,1915年才正式将此昆虫病原细菌命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)

1938年,第一个苏云金芽孢杆菌商品制剂Sporeine在法国问世,并在地中海粉螟的防治中得到了应用。科学家们最终证实苏云金杆菌对于鳞翅目、膜翅目、直翅目、鞘翅目等 13 0 多种害虫都具有杀虫活性。

国外发展

 最早商业化生产的Bt杀虫剂是1938年法国以半固体发酵法生产的产品,商品名称为Sporeine。美国最早的Bt杀虫剂商业化生产的产品是1958年由实验室生产的可湿性粉剂。1960年,美国共有五家公司生产Bt杀虫剂,在整个60年代期间,两项重大的进展极大地推动了苏云金杆菌杀虫剂的商业化进程,第一个进展是1969年Dulmage分离出HD-1菌株,其杀虫能力对不同的害虫为传统的20-212倍。此后的几年间,所有的美国厂家转向生产HD-1菌株制剂,成为农业及林业防治的主要产品。第二个进展是对苏云金杆菌杀虫剂商品建立了国际性的毒力标准,原先的产品是以芽孢数为标准的,但芽孢数并不能完全代表毒性,提出了用生物测定的方法来标定产品的毒力标准。

国内发展

我国对苏云金杆菌的起步研究要比最早研究的国家晚半个世纪,1955年曹骥先生等用从法国引进的商品制剂中分离的菌株,在实验室制备菌剂,用于防治玉米螟。1959年刘篙乐先生从当时的捷克斯洛伐克引进苏云金杆菌亚种,并用实验室制备的培养物防治杨天社蛾、菜粉蝶、松毛虫,均取得了显著的效果。1964年国家科委下达任务,兴建了专门的生产苏云金杆菌制剂工厂一武汉染料厂青虫菌车间。到1965年底,武汉生产的注册商标“三五牌”和长沙生产的“424”苏云金杆菌商品在我国问世。中国林科院也进行了液体深层发酵的研究。全国产量一度达到1500吨粉剂,但由于大多数厂家技术不过关,产品效价差,质量不可靠。导致苏云金杆菌杀虫剂一度走向低谷。

80年代以来,我国的苏云金杆菌杀虫剂开始进入一个稳定的发展阶段,武汉是我国主要的苏云金杆菌杀虫剂生产基地,湖北农科院率先研制和生产Bt液剂,粉剂和原粉,切实解决了生产过程中噬菌体污染问题和产品质量标准化问题,大幅度提高了发酵效价和降低生产成本。

杀虫原理

苏云金杆菌杀虫作用的主要成分是孢子形成过程中产生的伴孢晶体 ( CIPS ) , 它是单基 因表达的产物。伴孢晶体经敏感昆虫口服后, 在中肠碱性环境中, 被降解为活性的多肽片断的毒性片断包含三个不同的结构域。一般认为结构 I 参与孔道的形成 , 结构域 Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合, 结构域Ⅲ主要调节毒素的活性, 再与中肠受体蛋白结合 , 形成细胞膜通道, 破坏渗透膜, 引起细胞溶解 , 最终导致虫体死亡。

目前 , 全世界共分离到50000株苏云金杆菌,分为62种血清型和亚种。这些血清型和亚种分别具有不同的杀虫基因,加上每一种苏云金芽抱杆菌可同时含有多种杀虫基因, 从而 使苏云金芽抱杆菌的杀虫活性具有多样性。

主要登记的剂型

我国的苏云金杆菌登记的主要为'苏云金杆菌’和'苏云金杆菌(以色列亚种)’两类。主流登记剂型为 苏云金杆菌8000IU/微升 悬浮剂 以及 苏云金杆菌16000IU/毫克可湿性粉剂和苏云金杆菌32000IU/毫克可湿性粉剂.

据了解,由于悬浮剂高温易失活,运输不易,仅用于国内生产和使用。可湿性粉剂更易保存,为常规剂型。

主流复配剂型是与阿维菌素,甲维盐,茚虫威,杀虫单等复配。

生产工艺

苏云金杆菌并非来源于人工合成,是从自然界中得到,苏云金杆菌广泛分布于世界各地,从热带雨林到北极冻土带,从土壤、昆虫尸体、植物体表面、贮藏物或仓库灰尘、污水等基质上均可分离到该菌。据估计,目前世界上约有6000余个苏云金芽抱杆菌分离株。

苏云金杆菌制剂的生产主要包括三个步骤,一是发酵过程,包括菌种的选育、发酵培养基及工艺选择与优化,主要目的是培养杀虫晶体蛋白与芽孢,二是杀虫有效成分的浓缩与回收三是剂型化。其中,发酵过程是整个生产工艺的前提与关键。

苏云金杆菌对营养的要求不严。它不仅在全部是可溶性营养成分的培养基中能良好生长,而且在含固量很高的液体培养基中也能生长得很好,苏云金杆菌对营养条件要求不高,能在多种氮源、碳源和无机盐组成的营养基中生长增殖。氨基酸对苏云金杆菌的生长起着重要的作用,一般来说,多数菌株只需要一种氨基酸作为外源性氨基酸来完成细胞生长及芽孢、晶体的合成。

苏云金杆菌可利用碳氮源丰富的工业废水进行生产,可以节约能源,降低了生产成本,而且在治理环境的同时变废为宝。

专利情况

以苏云金杆菌及Bacillusthuringiensis为关键词检索,目前全球共有苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)相关专利473个,主要集中在苏云金杆菌的菌株,发酵技术以及使用方法。

2019年全球共计申请苏云金杆菌相关专利16个,中国占了绝大多数为14个。

出口情况

  我国苏云金杆菌的主要生产区域为武汉,2018年我国共出口苏云金杆菌相关制剂产品814.8万美元。其中主要目的市场为东南亚国家:泰国,越南,缅甸等;及南美洲国家:秘鲁,哥伦比亚等国。另外东欧部分国家也从我国进口苏云金杆菌。共同点是苏云金杆菌大的市场主要是水果等农产品出口国。尤其是主要面对欧美国家的农产品出口国,生物农药可以有效降低产品农药残留的风险。

     出口的剂型主流为可湿性粉剂。

未来的发展趋势

苏云金杆菌的市场经历过短暂的停滞(80年代技术难以突破,活性低)后近年来持续增长,主要的增长点为:

1.对环境友好

由苏云金杆菌源于昆虫病原细菌的活体, 在环境中参与能量与物质循环, 在对作物施药后对水体、土壤、大气都不会产生污染, 也不会在作物中残留, 更不会产生生物 富集等现象。

2. 对非靶标生物无杀伤力

苏云金杆菌制剂是胃毒剂, 是通过害虫进食后而达到杀死害虫的目的。不会对害虫的天敌,如捕食蜘蛛类、食虫蝽类、瓢虫类和草蛉等产生影响。

 3. 杀虫机制独特

传统农药大多数都是神经毒剂, 而苏云金杆菌为胃毒剂,因此在害虫综合治理中, 对抗药性严重的害虫高效。

 4. 生产过程对环境友好

可以用工业废水作为培养基,既可以处理废水,又可以大大降低其生产成本。

    虽然苏云金杆菌优势明显, 但也面临着剂型单一,活菌运输和储存条件受限等缺点。但作为微生物农药的老大哥,相对其他微生物农药更加成熟。磊子认为对其各种不同活性的菌株开发以及与传统化学农药的复配将会成为未来的主流。根据转基因BT抗虫棉的推广来看,未来需要注意的是长期使用导致的主要害虫数量降低导致次生害虫占据其主要生态位(棉铃虫减少后绿盲蝽数量大幅增加)。

感谢武汉科诺周波提供的数据和信息支持。

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