如何提高RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？

Q1－qPCR

问：如何提高RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？

答：

1. 确定模板RNA 完整性，无DNA污染；

2. RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂；

3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase 抑制剂RNasin；

4. 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱；

5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果；

6. 设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

Q2－GCBI

问：请问什么时候能出个GCBI的使用教程啊，真心没什么时间自己研究啊

答：GCBI的教程可不是一个，而是好多好多个。小编已经整理成目录，下面是打开方式：

1. 复制下面链接，用浏览器打开即可查看；链接：http://college.gcbi.com.cn/helpme

   
   

2. 电脑登陆“GCBI学院”，进入“GCBI帮助中心”即可查看。

Q3－生信分析

问：通过正常组与疾病组RNA测序后进行差异表达分析，筛出来后进行GO注释得到的转录因子是否可以认为是关键转录因子？

答：不可以。转录因子的作用一般不是通过基因表达量的差异体现的，而是与入核机制，和启动子结合等调控功能有关，所以在疾病中研究转录因子主要是chip-seq或者RNA pull down -MS。

如果没有已知的相关研究报道，也可以通过ATAC-seq和RNA-seq联合分析来筛选可能的转录因子，最后通过chip-seq来确认。

Q4－高通量测序

问：做完测序后续还需要做哪些实验？ 

答：测序分析完成后，客户根据结果挑选目标基因或目标位点进行验证，验证符合后可以进一步做扩大样本验证和功能实验。

Q5－生信分析

问：分析结果中实验组某一样本的表达值与同组差异较大，不在均线，质检合格，是测序还是样本处理有问题，或者其他问题？

答：如果样本是同一批次处理的，存在差别时，一般是因为样本准备的问题；其次在测序之前，可以通过抽提的RNA质量和文库质量来判定样本之间的差别。

Q6－生信分析

问：启动子promoter区怎么预测吗？有什么推荐的网站或软件吗？

答：模式生物的话，比如人， 一般就是指起始密码子上游1-3Kb 的区域，推荐工具：https://molbiol-tools.ca/Promoters.htm

Q7－数据库

问：有gene symbol和蛋白名称对应的数据库吗，想做二者的转换

答：uniprot数据库。网址：

https://www.uniprot.org/