四种方法教你分离血管内皮细胞，看看你是不是这样分离的？

导读

血管内皮细胞(endothelial cell, EC)是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。本文主要介绍几种血管内皮细胞的分离方法。

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1、酶消化法大血管内皮细胞的分离

人脐带动、静脉(或其它大血管)

a. 在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。

b. 在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带(25cm左右，不超过6h)，选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。

c. 注入0.1%胶原酶(1型)溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37℃无菌的D-Hanks液中，消化15min后取出。

d. 收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液(pH 7.2)冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7～10min。

e. 去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。

f. 其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。

2、酶消化法小血管内皮细胞的分离

兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。

a. 将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。

b. 用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37℃水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15～20min后，见酶液稍有混浊，即加入等量的含20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。

c. 收集消化后的酶溶液以1500r/min离心5min，弃上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞。

3、酶消化——机械刮脱法猪主动脉EC的分离

a. 麻醉状态下，在颈部切口，分离并剪断颈动脉，放血处死。在无菌条件下，作胸腹联合切口，迅速打开胸腔，分离并取出胸主动脉和腹主动脉，置含D-Hanks液的培养皿中，尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，然后用D-Hanks液多次冲洗血管外表及血管管腔内的凝血，再放入新装有D-Hanks的溶液中。

b. 纵何剪开血管，反复冲洗干净血管内壁后，在另一无菌大培皿中，滴加薄薄一层0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液，将主动脉内膜面朝下铺在酶混合液之上。在37℃条件下，让内膜与酶溶液充分接触并消化10～20min，再加入含少量20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。

c. 把上述主动脉移至另一无菌培养皿，用小手术刀轻轻将内皮刮下。先顺向有次序地刮内膜1～2次，然后再横向刮1～2次，用M199液将内皮细胞收集到离心管中，以1000r/min离心7～10min，去上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞备用。

4、机械刮脱法血管内皮细胞的分离

取长度为20cm的大血管，用D-Hanks液将血管内、外冲洗干净后，无菌条件下沿纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露，再用D-Hanks液冲洗2次，然后用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞，刮取时，动作应轻柔均匀，刮刀与表面的角度约为60℃，每处只能刮1次，不可刮血管的边缘，刮下的细胞悬浮于M199液中，以1000r/min离心7～10min，去上清，再重复洗涤1次，重新悬浮于20%小牛血清M199培养液中备用。