作者单位：浙江大学邵逸夫医院
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二常见的神经系统变性疾病，主要累及中脑黑质含神经黑色素（Neuromelanin, NM）的多巴胺能神经元。NM是神经元胞质内的不溶性色素复合体，其结构组成和合成机制尚未完全阐明。
NM的生物功能具有双重性：在生理状态下，结合金属离子、药物、毒物等，发挥神经保护效应；而在PD等病理状态下，与胞质内过量的Fe3+、α-突触核蛋白等相互作用，或通过Ca2+稳态的破坏，小胶质细胞过度激活等机制损伤神经元，表现毒性效应。
研究NM与PD的联系及其作用机制，将有助于更好的理解PD的致病途径以探索新的治疗策略。
此外，NM敏感的MRI（NM-MRI）对PD具有一定的诊断价值。
神经黑色素、帕金森病、Fe3+、Ca2+、α-突触核蛋白、小胶质细胞
帕金森病是一种常见的神经系统变性疾病，临床症状包括运动症状和非运动症状。
运动症状主要有肌强直、运动迟缓、静止性震颤和姿势平衡障碍，这些症状可能是中脑黑质（Substantia nigra, SN）含NM的多巴胺能神经元进行性丢失所致。SN和纹状体之间的信号通路与肌肉运动的调控相关，因此，该通路的失衡，即SN传递到纹状体的多巴胺（Dopamine, DA）水平显著降低，引起乙酰胆碱递质系统功能相对亢进，与PD运动症状的产生密切相关[1]。
非运动症状主要包括自主神经功能障碍、精神障碍和感觉障碍等，这些症状可能是其他神经递质通路（如胆碱能、5-HT能、GABA能）受损所致[2]。
PD的发病通常是环境、遗传等因素相互作用的结果。杀虫剂、除草剂（如百草枯）、金属离子的暴露是重要的环境危险因素[3]。
近年来，关于PD相关的基因突变的研究取得了较大进展，筛选出的基因包括SNCA、LRRK2、GBA、MAPT[4]等。衰老是已知的散发性PD发病最大的危险因素。随着年龄增加，对于维持SN神经元正常功能所必需的过程，如DA代谢、野生型线粒体DNA拷贝数、蛋白质降解等都会下降[5]。
此外，线粒体功能障碍[6]、DA及其代谢产物的氧化作用[7]、钙稳态失衡、蛋白酶体功能障碍、神经免疫炎症、铁离子毒性等都被认为可能参与了SN多巴胺能神经元变性、死亡的过程。
在PD病程中，含NM的多巴胺能神经元首先受累，表现一定的损伤易感性，这一现象引起研究者对于NM及其在PD中的作用的关注。比如有研究表明，人SN多巴胺能神经元表达嗅觉受体（Olfactory receptors, ORs），调节NM的产生。在PD中ORs表达下调，通过某些芳香物质作为其功能配体，诱导NM生成，从而拮抗PD等神经变性疾病[8]。
本篇综述总结了NM的结构组成、生物合成通路、正常生理功能，以及与各种离子、分子和细胞的交互作用，试图阐明NM在PD发生发展中的作用。此外。还简要介绍了NM-MRI在PD诊断中的作用。
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神经黑色素的生理基础
神经黑色素是一种深色的、难溶的色素，在脑干、SN、蓝斑核的儿茶酚胺能神经核团中含量最多，但是含NM的神经元是广泛分布于脑组织的，包括延髓、下丘脑、小脑、壳核和运动前皮层。
超微结构研究表明，NM与脂质体和蛋白质一起包裹于胞浆细胞器内，在某些情况下，还能看到周围的双层膜[9]，这些NM细胞器形状不一，大小约500-3000nm[10]。NM细胞器的形成过程目前仍不清楚。
研究认为高活性的DA氧化产物与蛋白质相互作用，形成黑色素-蛋白质复合物，并结合铁，随后被自噬囊泡吞噬，再与溶酶体融合，进一步和脂质、蛋白质相互作用，最终形成含NM的细胞器[11]。从这一过程来看，NM似乎代表了胞质内DA及其氧化产物的清除途径。
关于NM的合成通路和结构组成，目前所知有限。在3岁左右，这种色素开始以小的白色颗粒出现在黑质多巴胺能神经元的胞质中，其大小和数量随着年龄的增长而增加，到成年时，NM占据了平均47%的细胞质。20岁以后，色素化细胞的比例保持稳定，但色素的数量仍随着年龄增加而增加[12]。55-60岁以后，组织学研究提示色素数量或者随年龄增长而减少，或者无明显变化。这种差异可能是由于计数方法的不同。
最近的一项研究通过NM敏感的磁共振成像，收集了134名5-83岁的健康个体SN色素沉着的生理变化的数据，分析表明在老年阶段，多巴胺能神经元中的色素含量是减少的[13]。
NM由大小约350nm的微粒组成，而这种微粒又是由直径约30nm的小球形亚结构组成，这样的结构与人头发、眼睛中的天然黑色素的结构类似[14]。另有研究表明NM具有多层（类似石墨）三维结构，是一种复杂的聚合物体系，每一层都由黑色素基团结合脂肪链、肽链组成[15]。
NM由黑色素、脂质、蛋白质、金属离子共价结合形成，其黑色素部分是由真黑色素包绕脱黑色素核心所形成的球形电子致密的聚集体[14]，故同时有真黑色素和脱黑色素的特性。
在NM中，具有二羟基吲哚和苯并噻嗪环结构的黑色素部分共价结合脂肪链和肽段[16]。过去曾认为脂质是NM中的主要组分，但最近的一项研究表明共价结合于NM的脂质只占色素总重量的18%，蛋白质占比约12%，而黑色素无疑是NM的主要成分[11]。
目前关于NM的生物合成主要有两种观点，一种认为是酶促反应，一种则认为是DA的自氧化过程。酪氨酸酶是外周黑色素合成的关键酶，但似乎并不参与NM的合成，因为在SN中并未发现该酶的表达。
研究表明过氧化物酶、前列腺素H合成酶、黄嘌呤氧化酶、酪氨酸羟化酶、单胺氧化酶等都可能与NM的合成相关，然而，目前对于具体哪些酶参与NM合成的哪些步骤仍不明确。另外，也要考虑到儿茶酚胺的自氧化过程：儿茶酚胺氧化生成醌类化合物，再添加硫醇基团[17]。
由于其组成和生物物理特性，黑质的NM具有双重作用：保护和/或毒性作用，主要取决于细胞环境。与外周黑色素类似，NM具有抗氧化和清除自由基的能力，有助于缓冲细胞氧化应激。这对儿茶酚胺能神经元尤其重要，因为它们承受着由SN和NM中高水平铁产生的高氧化负担、低水平抗氧化分子和DA代谢所带来的风险[17]。
NM的另一个显著特点是能够结合多种离子和分子。NM对铁、铜和锌等过渡金属有很强的亲和力[10]。如铁与黑色素部分结合，以不活跃的状态保存，从而减少羟基自由基的形成。NM可以与多种有机分子包括药物、杀虫剂和有毒化合物等结合，因此能够控制这些分子的胞内浓度[18]。这种蓄积作用显然具有神经保护效应，但同样也是其神经毒性作用的基础：由变性、死亡的神经元释放出的NM，长期存在于胞外环境，并缓慢释放这些蓄积物质，造成持续的细胞损伤。
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NM与PD的联系
实际上，NM的合成本身就是一个神经保护过程，它是由神经元胞质内过量的、游离的（不在突触囊泡内）DA激活的，因为在大鼠神经元培养中观察到NM的合成与突触囊泡单胺转运体II的表达呈负相关[19]。DA氧化成多巴醌，环化生成氨基色素，再重排形成5,6-二羟基吲哚，自氧化为5,6-吲哚醌，最后形成NM。如果没有NM的合成，胞质DA的累积及其氧化产物会引发神经毒性[19]。
值得注意的是，在DA氧化生成NM的过程中，同样会产生各种代谢产物，之所以不表现细胞毒性，可能是一些酶的存在，如SN多巴胺能神经元中的DT-硫辛酰胺脱氢酶[20]。
研究发现，与健康的年龄匹配的对照组相比，PD患者黑质中NM减少超过50%[21]，表明PD主要累及含NM的神经元。广泛深入的研究为NM所致的神经元易感性提供了可能的解释。
铁以Fe3+的形式催化胞质内DA氧化成醌类，参与了NM的合成，是NM组成和结构的一部分[17]。通过各种定量、半定量的分析检测方法，发现在PD患者的SN中，总铁的浓度明显增加[22]，超过NM、铁蛋白等复合物的铁缓冲能力。
NM与铁的结合位点，根据亲和性的不同分为高亲和性与低亲和性位点。目前对于两种位点结构的差异尚不明晰，但铁会优先与高亲和性位点结合，并以非活性形式储存，以阻断Fenton反应和维生素C氧化，这就是前述的NM的细胞保护作用。
在铁过载的情况下，如PD，NM的高亲和性位点被饱和，铁会结合到低亲和性位点，并且是以活跃状态不稳定结合的，因此可以通过氧化还原反应表现毒性作用[23]。
DA脱氨基自氧化生成的H2O2与游离的Fe3+、铁饱和的NM共同驱动Fenton反应，从而释放细胞毒性羟基自由基，导致SN神经元选择性变性。此外，NM中铁过载可催化DA氧化生成更多的多巴醌，诱导蛋白质氧化修饰，并伴随一系列的神经毒性过程[7]。
近年来对于α-syn在PD发病和疾病进展中的作用已经有了深入的了解：其单体相互作用形成可溶的低聚物，表现出细胞毒性，如损伤线粒体结构，抑制复合体I的功能，促进活性氧的产生；增加细胞膜渗透性，破坏细胞稳态；抑制蛋白质降解系统，包括泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统，干扰正常的细胞生理过程，最终引起细胞损伤死亡等[24]。
最近的研究表明在衰老人群和PD患者的脑黑质神经元中，NM能够诱导α-syn的表达和聚集。与对照组相比，PD患者中脑内，含NM的 DA能神经元的α-syn mRNA水平明显升高，支持NM诱导α-syn表达的观点[25]。NM也能增加DA能神经元内α-syn的聚集，但具体的机制仍然不明。目前的研究提示铁饱和的NM产生大量自由基，增加氧化应激，可能促发α-syn的聚集；累积的NM抑制蛋白酶体功能，导致α-syn的清除减少；此外，NM可能与其他促进年龄相关性“自噬应激”的因素协同作用，影响α-syn的降解[24]。
有研究报道了α-syn的过表达增加了SH-SY5Y、PC12多巴胺能神经元中NM的含量，表明α-syn可能促进NM的生物合成[26]。然而α-syn诱导NM的生物合成的具体机制并不明确，有研究提示α-syn能够调节NM合成的酶促反应通路中的部分酶（如酪氨酸羟化酶）的活性[27]。
通过对无神经系统疾病的人群的尸体解剖样本中黑质和NM中的金属离子含量进行研究，发现在NM中含有丰富的钙离子。钙离子在NM中的浓度明显高于对应的SN中的浓度，并且在SN中的浓度越低，在NM中的浓度就越高。SN中，Ca2+ 低于检测值下限，而在NM中其浓度达8 mg/g干重。考虑到其结合Ca2+的特性，NM可能作为SN中钙库，与胞内Ca2+稳态的维持相关[28]。
Ca2+是细胞凋亡级联反应中的重要信号分子，可能在神经保护中起到关键作用。Ca2+在人体中作用广泛，是维持正常生理功能必不可少的离子，受到各种Ca2+结合蛋白的高度调控，这些蛋白在细胞内外环境中负责转运、信号传递和缓冲Ca2+水平。因此，NM结合Ca2+的特性值得更多的关注。
Ca2+作为第二信使在生物学上的重要性要求严格调控细胞的钙稳态，维持其正常功能。SN神经元丢失首先是每个细胞平均NM数量的减少，之后神经元随机死亡。最近的磁共振研究证实PD的病理生理表现开始于SN中NM的减少[29]。
如前所述，PD患者SN中的NM浓度与年龄匹配的对照组相比下降超过50%，其含量的减少降低了对Ca2+缓冲能力，使神经元更容易受到细胞损伤机制的影响。Ca2+稳态的破坏导致Ca2+诱导的细胞内损伤，其后果已经被PD的Ca2+假说所证实[30]。因此，不同于Fe3+，在Ca2+信号通路环节，维持NM的正常数量似乎体现了细胞保护作用，反映了NM作用的双重性。
小胶质细胞、树突状细胞（DCs）、细胞毒性T细胞（CTL）等免疫炎症细胞，参与了中枢神经系统损伤和疾病的内源性免疫反应，从而发挥神经保护或神经毒性作用。
在PD等神经变性疾病中，发生变性、死亡的DA能神经元释放NM到胞外环境，当小胶质细胞暴露于NM，其在功能和形态上都被激活，产生大量细胞外超氧化物、细胞内活性氧、NO、TNF-α和PGE2，引发神经炎症，从而损伤神经元[31]。根据最近的一项研究报道，NM是通过caspase-8依赖机制激活促炎小胶质细胞[32]。受损的多巴胺能神经元进一步释放NM，激活更多的小胶质细胞，这种恶性循环将显著加快PD的病程进展。
体外试验中，NM被树突状细胞（DCs）识别、吞噬，并触发其成熟和功能激活，在体内，DCs将胞外NM从脑组织转运至颈淋巴结，提呈给T、B淋巴细胞，引发PD相关的适应性自身免疫反应[33]。NM激活的小胶质细胞释放的细胞因子诱导神经元MHC-I的表达，DA能神经元内化外源性卵清蛋白，并由MHC-I提呈该蛋白抗原，在细胞毒性T细胞存在的条件下，触发DA能神经元的死亡[34]。
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NM敏感的磁共振成像在PD诊断中的作用
NM-MRI对于PD的诊断、鉴别和病程监测等具有一定的价值。当与铜、铁等金属结合时，NM表现出顺磁性，导致T1缩短效应，因此，在3T场强中使用T1加权快速自旋回波序列MRI，由于T1弛豫时间的延长，脑组织信号受到抑制，含有NM的核团可表现出高强度信号，从而与周围脑组织相区分[35]。一般使用 的指标包括NM阳性区域面积、体积、与周围脑组织相比的对比度（CR）等。Sasaki等发现SN的信号在健康对照是显著的，而在PD患者中减低，这与病理结果是相一致的，提示MRI图像中NM相关的对比反映了含NM的神经元的丢失和/或胞内NM含量的减少[36]，对PD的诊断具有较高的特异性和灵敏性。
通过对未经治疗的特发性震颤（Essential tremor，ET）、新发的震颤为主的PD（PDT）患者和健康对照的对比研究发现，在PDT患者SNc外侧部和中间部的宽度和对比噪声比显著下降，可视化分析提示SNc各亚区的可视化总分也是显著下降的，因此NM-MRI可作为一种潜在的工具鉴别ET和PDT等震颤相关疾病[37]。
SN致密部（SN pars compacta，SNc）外侧部信号衰减最显著，中间部其次，而内侧部信号相对保留。研究表明，SNc信号强度，标准化的前部、后部和总体NM体积与UPDRS评分呈负相关。此外，Hoehn-Yahr分期与NM敏感的SNc体积、SNc对比度之间表现为负相关关系[35]。需要注意的是，虽然这些研究似乎提示了NM测量值和PD运动症状严重性之间存在强关联性，但这些研究的样本容量较小，因此需要大样本、囊括疾病不同阶段的的研究进一步证实上述发现。
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总结和展望
PD主要累及中脑黑质，该脑区广泛分布含NM的多巴胺能神经元，并且在病程中这些神经元首先受累，因此引发了我们对于NM及其与PD的关系的研究兴趣。目前已经知道NM是一种结构和组分非常复杂的色素复合体，尚需进一步研究。NM和脂质体、蛋白质形成NM细胞器，定位于神经元胞质内。NM的合成底物是胞质内过量的、游离的DA，但具体的合成机制尚不明确。
生理状况下，NM表现为神经保护作用：NM本身具有抗氧化特性，可减轻细胞氧化应激；NM的合成利用了胞质内过量的DA，减少DA及其毒性氧化产物的累积；NM具有和多种金属离子、化合物结合的能力，从而控制这些物质的胞内浓度，防止神经毒性作用。
在PD等神经变性疾病中，NM可以表现出毒性作用。PD病程中，SN多巴胺能神经元内铁过载，活跃态的铁发挥氧化还原活性，介导胞内活性氧的产生，损伤SN神经元。NM的聚集促进α-syn的表达和聚集，反过来α-syn也能诱导NM的合成，两者的相互作用影响了神经元的功能。变性死亡的神经元释放出的NM激活小胶质细胞，使之释放多种毒性物质和促炎因子，或通过DCs的提呈，激活T、B细胞介导的免疫反应，最终引发神经免疫炎症，导致神经元损伤。
此外，随着SN多巴胺能神经元变性死亡，作为胞内钙库的NM相应减少，钙稳态被破坏，由此引发一系列Ca2+介导的级联反应，增加神经元损伤易感性。
综上所述，NM似乎并不是PD发病的起始因素，但在病程中通过和一些物质的相互作用，促进SN多巴胺能神经元的变性、死亡，加速PD的病程进展。此外，NM-MRI使SN可视化，用于PD的诊断和鉴别诊断，监控疾病的发展和治疗的效果等。
关于NM的组分、结构和合成通路，可能需要应用更多、更先进的技术和手段进一步研究，而NM与胞内外各种离子、化合物的交互作用，可能部分阐明了PD等神经变性疾病发生发展的机制，为研究延缓PD疾病进展的机制提供新的思路。对于NM-MRI的应用价值尚需进一步研究。
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