新型冠状病毒SARS-CoV-2的出现及大流行、甚至发生变异,无疑给针对敏感性和特异性的检测技术带来了挑战。来自塞浦路斯大学Chrysostomou A等人进行了一项关于“A Multi-Allelic Molecular-BeaconBased Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of the Coronavirus SARSCoV-2 from Clinical Samples”的研究,该研究提出了一种基于多等位基因分子信标(MB)的实时RT-PCR检测SARS-CoV-2的方法(基于美国专利7709188B2),同时考虑到了其由于遗传漂变和重组而产生的内在多态性,以及将遗传上不同的菌株连续和多次引入人群中的可能性。 用于该分析的MB、引物和目标扩增子是从头创建的,用于检测SARS-CoV-2的S、N、M和E基因片段。并利用S、N、M和E基因的寡核苷酸片段设计了内部阳性对照(IPC)。通过mfold DNA折叠程序研究每个MB的折叠和结构以及其热力学细节。除E和IPC分别用TET和FAM标记外,其余MBs均在3'端用DABCYL标记,5'端用HEX标记。每个MB的茎段为6个核苷酸(nts),GC含量很高,而loop为24~26个nts,设计为具有错配耐受性(仍然可以检测多态性替换),并且与待扩增的基因片段互补。 研究者通过IDT Oligo Analyser webtool检测引物和MB的热力学相容性和二聚体形成;进行熔解曲线分析以评估每种MB的热力学特性;通过MEGAscript T7转录试剂盒进行体外转录,为每个基因开发合成RNA转录物,并用作阳性对照;最后采用TaqPath一步法RT-PCR混合物完成实时RT-PCR分析。 该检测使用在细胞培养中生长的冠状病毒株“BetaCoV/Germany/BavPat1/2020 p.1”的纯化RNA进行检测,其中MBs正确识别了每个基因。同时,该检测还得到了世界卫生组织(WHO)和分子诊断质量控制(QCMD)的两个SARS-CoV-2外部质量评估(EQA)小组的验证。这些小组的样本具有不同的冠状病毒株和病毒载量,从阴性、临界阳性到高度阳性。该检测显示100%成功识别了所有6个WHO小组样本和所有8个QCMD样本。在进行SARS-CoV-2监测的前提下,塞浦路斯大学使用该检测(经生物伦理学批准)对学生和工作人员的合并鼻咽样本进行诊断测试。最终,对2231例个体的534个集合样本(平均每个集合5个样本)进行了测试。阳性库中的个体被召回进行测试,其中16人被确定为阳性。 综上所述,通过本项研究,研究者建立了一种高效、重复性好的实时RT-PCR检测方法,并通过EQA、参考样本和公共诊断监测进行了验证。该方法具有较高的准确性和特异性,可用于SARS-CoV-2和其他新出现的突变病原体的检测。 参考资料:Chrysostomou A, Hezka Rodosthenous J, Topcu C, et al. A Multi-Allelic Molecular-BeaconBased Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of the Coronavirus SARSCoV-2 from Clinical Samples. European Meeting on HIV & Hepatitis 2021. Abstract 20.
参考资料:Dusek M, Ehret R, Obermeier M. High sensitivity pool testing for SARSCoV-2 RNA from throat wash and nasopharyngeal swabs. European Meeting on HIV & Hepatitis 2021. Abstract 4.