稀有样本做T、B亚群，用这一管方案吧

在临床研究中，经常会碰到样本量少或样本中细胞量少的问题，对表型的检测造成了很大困扰。所以，尽可能用最少的管数来一次性解决，当然是最理想的。

瑞士的Brodie T等人给出的这个单管13色方案，针对脑脊液（CSF）（含10-100,000个细胞）以及全血淋巴细胞染色进行了优化。他们在研究中，主要是做脑脊液样本，所以采样后不超过1小时就进行处理，细胞活力不会受太大影响，所以方案中不包含死活鉴别染料，见下图：

Brodie T在其研究项目中针对的病种是多发性硬化，一类自身免疫性疾病，同时检测脑脊液和外周血中的T、B淋巴细胞亚群，对于了解两者之间的免疫细胞迁移相当有帮助。

由于髓磷脂特异性T细胞在多发性硬化的神经炎症中起主要作用，所以方案中比较注重T细胞各功能状态的区分，以CCR7、CD45RA区分初始T（TN）、中央记忆T（TCM）、效应记忆T（TEM）、效应记忆RA＋T（TEMRA），在记忆性群体中，进一步根据趋化因子区分出Th1（CCR4－CCR6－）、Th2（CCR4＋CRTh2＋）、Th17（CCR4＋CCR6＋）。

来看T细胞的分析，正式分析开始前，都需要通过排除粘连体→排除碎片和不相关的细胞区域→排除非特异性荧光（主要是多色流式常见）获得纯粹的单个状态较好的细胞，接着就是圈CD3＋的T细胞，分为CD4＋T和CD8＋T两类：

对CD4＋T细胞分群，CD45RA+CCR7+ TN、CD45RA-CCR7+ TCM、CD45RA-CCR7- TEM，这个图作者没放出来，只是针对后续TEM进一步分群放出了下图，即按照CD27分为CD27＋和CD27－两类，接着对这两类细胞进一步根据CRTh2、CCR4、CCR6区分为Th1（CCR4－CCR6－）、Th2（CCR4＋CRTh2＋）、Th17（CCR4＋CCR6＋），最后的CD28－T用于找出那类可能的自身反应性T细胞：

CD8＋T的分群也与前述的CD4＋T类似，CD27－CD8＋T的细胞毒能力更强：

CSF中的寡克隆带和MS病灶中的抗体沉积物的存在，支持抗体和B细胞在疾病发病机制中的作用。 抗CD20治疗（即利妥昔单抗和更新的Ocrelizumab）在复发缓解型MS患者中的成功清楚地证明了B细胞在MS中的重要性。所以此方案中包括了B细胞标记CD27、IgD，区分出初始B（NB）、边缘区样B（MZLB）、记忆B（MB）、浆细胞。设门也比较简单，在第一个图中选CD3－细胞，然后根据CD19/CD138分布，圈出CD138＋的浆细胞和CD19＋CD138－的B细胞，对B细胞按照CD27/IgD的分布，圈出IgD＋CD27－的初始B、IgD＋CD27＋的边缘区样B、IgD－CD27＋的记忆B：

如此，稀有样本，一管完成了T、B常见亚群的分析，简单、快速、高效。

参考文献：Brodie T, Rothaeusler K, Sospedra M. OMIP-033: A comprehensive single step staining protocol for human T- and B-cell subsets. Cytometry A. 2016 Jul;89(7):629-32. doi: 10.1002/cyto.a.22889.

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