摘要：调节性T细胞 (简称Treg)，是一群具有免疫抑制功能的特殊CD4+ T细胞，对维持机体的免疫耐受及免疫稳态至关重要 (Sakaguchi，2004)。虽然Treg细胞都特异性表达转录因子Foxp3，但Treg也不是均一的细胞亚群。依据分化场所和前体细胞的不同，Treg细胞可以分为胸腺来源的tTreg的和外周诱导形成的pTreg，目前主要由Nrp-1和Helios这两个分子来区分tTreg和pTreg (Josefowicz和Rudensky，2009)。此外，依据其活化状态，Treg细胞可以分为CD44loCD62Lhi静息状态的Treg细胞 (简称“cTreg”) 以及CD44hiCD62Llo活化状态的效应Treg细胞 (简称“eTreg”)；cTreg高表达归巢受体CD62L以及趋化因子受体CCR7，主要存在于二级淋巴器官；相反，eTreg细胞会下调表达CD62L和CCR7，上调表达活化相关分子如CD44、ICOS、KLRG1、CTLA4、CD69等，主要定居于非淋巴器官组织中 (Smigiel等，2014)。eTreg细胞还可以进一步上调效应T细胞相关的转录因子如T-bet、GATA3、RoRγt以及Bcl6发育成特定的效应Treg细胞如Th1-Treg、Th2-Treg、Th17-Treg以及TFR，促使表达相应的趋化因子受体，来更好的发挥特定的免疫抑制功能 (Josefowicz等，2012；Cretney等，2013)。
Treg细胞的成熟及发育缺陷是造成自身免疫性疾病产生的重要原因，因此分析其亚群分类对理解免疫稳态控制具有重要的意义 (Dominguez-Villar和Hafler，2018)。在此，依据Treg细胞表达表面及内部分子的差异，主要讲述如何运用流式细胞仪分析Treg细胞主要亚群分类。
材料与试剂
一、 小鼠胸腺、淋巴结单细胞悬液制备相关耗材及试剂
移液枪头
6 cm平皿 (NEST, catalog number: 110001)
15 ml聚丙烯离心管 (康宁, catalog number: 352096)
1.5 ml离心管 (国产)
200目白色尼龙网 (达科为, catalog number: DKW33-N25)
5 ml流式管 (圆底无盖未灭菌，国产)
0.22 μm无菌滤膜 (Millipore, catalog number: SLGP033RB)
6至8周龄大小的Foxp3-GFP-hCre BAC转基因小鼠
75%酒精
1x ACK红细胞裂解缓冲液 (见溶液配方)
1)
氯化铵 (NH4Cl)
2)
碳酸氢钾 (KHCO3)
3)
乙二胺四乙酸 (EDTA)
单细胞悬液 (见溶液配方)
1)
DMEM培养基 (Invitrogen, catalog number: C11965500CP)
2)
胎牛血清 (FBS) (Bioind, catalog number: 04-001-1ACS)
3)
氨苄西林钠
4)
硫酸链霉素
二、 流式检测试剂及抗体
流式检测相关试剂
1)
1 x PBS缓冲液 (见溶液配方)
氯化钠 (NaCl)
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)
氯化钾 (KCl)
2)
1x FACS缓冲液 (见溶液配方)
牛血清白蛋白 (BSA)
叠氮钠 (NaN3)
3)
4% PFA (多聚甲醛) 固定液 (工作浓度为1%) (见溶液配方)
氢氧化钠 (NaOH)
多聚甲醛粉末
细胞表面分子流式检测抗体 (见溶液配方)
1)
CD4-PercP-Cy5.5 (克隆号：RM-5，eBioscience, catalog number: 45-0042-82)
2)
CD8α-AF700 (克隆号：53-6.7，Biolegend, catalog number: 100730)
3)
Neuropilin-1-Biotin (R&D, catalog number: BAF566)
4)
Streptavidin-APC (Biolegend, catalog number: 405207)
5)
CD44-APC (克隆号：IM7，eBioscience, catalog number: 17-0441-83)
6)
CD62L-PE (克隆号：MEL-14，Biolegend, catalog number: 104408)
7)
ICOS-APC (克隆号：7E.17G9，eBioscience, catalog number: 17-9942-82)
8)
KLRG1-APC (克隆号：2F1，eBioscience, catalog number: 17-5893-82)
9)
CCR7-PE (克隆号：4B12，eBioscience, catalog number: 12-1971-82)
10)
CD25-PE (克隆号：PC61.5，eBioscience, catalog number: 12-0251-82)
11)
CXCR3-APC (克隆号：CXCR3-173，eBioscience, catalog number: 17-1831-82)
12)
CXCR5-APC (克隆号：2G8，BD Bioscience, catalog number: 560615)
细胞内部分子流式检测抗体
1)
Foxp3-BV421 (克隆号：FJK-16s, eBioscience, catalog number: 48-5773-82)
2)
Helios-PE (克隆号：22F6, Biolegend, catalog number: 137216)
3)
CTLA4-PE (克隆号：UC10-4B9, eBioscience, catalog number: 14-1522-82)
4)
Ki67-eF660 (克隆号：SolA15, eBioscience, catalog number: 50-5698-82)
5)
Bcl2-AF647 (克隆号：BCL/10C4，Biolegend, catalog number: 633510)
6)
T-bet-PE (克隆号：eBio4B10, eBioscience, catalog number: 12-5825-82)
7)
GATA3-PE (克隆号：TWAJ, eBioscience, catalog number: 12-9966-42)
8)
IRF4-eF660 (克隆号：3E4, eBioscience, catalog number: 50-9858-82)
9)
RoRγt-APC (克隆号：B2D, eBioscience, catalog number: 17-6981-82)
10)
Bcl6-PE (克隆号：GI191E, eBioscience, catalog number: 12-9887-80)
Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 00-5523-00)
该试剂盒所包含的试剂：
1)
固定/透化浓缩液 (Fixation/Permeabilization Concentrate)
2)
固定/透化稀释液(Fixation/Permeabilization Diluent)
3)
透化缓冲液 (10x Permeabilization Buffer，简称10x Perm，使用浓度为1x，用超纯水稀释即可)
转录因子T-bet染色相关试剂
1)
固定/透化缓冲液即BD Cytofix/Cytoperm buffer (BD Bioscience, catalog number: 554722)，1x Cytofix/Cytoperm缓冲液直接使用即可
2)
透化/清洗缓冲液即BD Perm/Wash buffer (BD Bioscience, catalog number: 554723)，10x BD Perm/Wash缓冲液用ddH2O稀释至1x即可使用
仪器设备
组织剪
手持移液枪
玻璃组织研磨片、金属筛网、研磨棒 (均为国产)
台式小型高速离心机 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 75002430)
大型柜式离心机 (Kubota, catalog number: 5930)
BD LSRFortessa流式细胞仪 (5激光) (BD Bioscience，LSRFortessa)
实验步骤
一、小鼠胸腺、淋巴结以及脾脏中淋巴细胞的获取
用颈椎脱臼法迅速处死小鼠，用75%酒精喷洒小鼠体表消毒，剪开腹部以及四肢皮肤和腹膜。
分别取出小鼠胸腺、淋巴结、脾脏器官置于含有2% FBS的DMEM培养基中。
使用玻璃片的磨砂面研磨胸腺和淋巴结，以释放出淋巴细胞，随后将研磨液移至15 ml离心管中。
使用研磨棒和金属筛网研磨脾脏，释放出脾脏组织中细胞，随后将研磨液移至15 ml离心管中。
将胸腺、淋巴结、脾脏细胞研磨液以840 x g在4 °C离心2分钟，离心后弃上清。
加入1 ml 1x ACK红细胞裂解缓冲液 (提前放置于室温环境) 重悬细胞脾脏沉淀，轻轻吹打混匀，室温裂解1~2 min，840 x g，4°C离心2 min，用含2% FBS的DMEM重悬细胞。
将胸腺、淋巴结研磨液以及裂解过红细胞的脾脏细胞悬液在4 °C，840 x g离心2 min。
用2 ml含2% FBS的DMEM重悬细胞，用200目尼龙膜过滤，除去细胞碎片以及其它组织碎片。
计数，确定每个样本总的细胞数目以便于后期的染色或培养。
二、细胞流式染色 (涉及荧光蛋白GFP与Foxp3同时染色方法)
取1 x 106 ~2 x 106个淋巴细胞置于1.5 ml离心管中。
加500 μl 1x FACS洗涤细胞，4 °C，840 x g离心2 min弃掉上清。
注：管底残余的1x FACS缓冲液可以通过17,000 x g高速离心5秒钟去掉。
加入20 μl用1x FACS缓冲液稀释后的表面染色荧光抗体CD4-PercP-Cy5.5，CD8α-AF700以及其它细胞表面抗体，例如CD44、CD62L、ICOS、CXCR5等混合液，轻轻吹打混合均匀，4 °C避光染色30 min。
加入500 μl 1x FACS缓冲液终止染色反应，洗掉残余的抗体。
注：
1)
如果表面染色抗体中含有Biotin抗体，则需要进行细胞表面第二步染色，加入相应Streptavidin抗体 (同步骤2~4)。
2)
由于Foxp3本身的染色会造成荧光蛋白如GFP的猝灭，在这里我们采取预固定的方式来保留GFP荧光蛋白。见以下预固定步骤5~8。
加入500 μl 1x FACS缓冲液终止染色反应，洗去残余的抗体。
加入200 μl 1x PBS缓冲液 (室温) 重悬细胞，随后加入200 μl室温避光放置的2% PFA (提前用1x PBS缓冲液将4% PFA稀释至2%) 缓冲液，混合均匀后，室温避光固定8~10 min。
加入500 μl 1x FACS缓冲液终止固定反应，4 °C，840 x g离心2 min弃掉上清。
加入500 μl 1x FACS缓冲液，4 °C，840 x g离心2 min弃掉上清。
加入100 μl Foxp3染色专用固定液 (Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent体积比为3:1)重悬细胞，4 °C避光固定至少30 min。
加入500 μl Foxp3染色专用1x Perm (用ddH2O将10x Perm稀释至1x即可) 重悬细胞；4°C，840 x g离心2 min弃掉上清。
重复步骤10。
加入20 μl用1x Perm缓冲液稀释的Foxp3以及其它细胞内荧光标记抗体如CTLA4、Ki-67、Bcl-2以及转录因子相关抗体如GATA3、IRF4、RoRγt、Bcl6等混合液，4°C，避光染色1-2 h。
注：由于预固定会对Foxp3的染色造成一定的影响，所以此处染色时间会比较长。此外，染色过程中应每隔15 min左右用拇指弹一下管底，使得细胞更充分的接触抗体。
加入500 μl Foxp3染色专用1x Perm缓冲液，4°C，840 x g离心2 min弃掉上清，以洗掉残余抗体。
加入300 μl 1x Perm缓冲液重悬细胞，用200目白色尼龙网过滤细胞至流式管中。
流式细胞术检测细胞荧光表达情况。
注：
1)
流式上机检测之前一定要使用200目白色尼龙网过滤细胞以除去死细胞以及细胞碎片，否则容易堵塞流式细胞仪管道。
2)
该方法除适用于Foxp3抗体的染色，还适用于常见的细胞因子如IL-10、IFN-γ等与Foxp3的同时染色。注意：一旦涉及转录因子Foxp3的染色就必须使用Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒中相关的固定液和Perm缓冲液进行固定和破膜。此外，如果涉及到其它荧光蛋白与Foxp3的一同染色试验，要根据荧光强度和实验需求来摸索预固定的时间与条件，以更好的获取实验结果。
3)
涉及GATA3、RoRγt、Bcl6等转录因子染色时，最好使用Foxp3染色相关试剂，效果更佳。
三、转录因子T-bet染色方法
取1 x 106~2 x 106个淋巴细胞置于1.5 ml离心管中。
加500 μl 1x FACS洗涤细胞，4 °C，840 x g离心2 min弃掉上清。
注：管底残余的1x FACS缓冲液可以通过17,000 x g高速离心5秒钟去掉。
加入20 μl用1x FACS缓冲液稀释后的表面染色荧光抗体CD4-PercP-Cy5.5，CD8α-AF700，CXCR3-APC混合液，轻轻吹打混合均匀，4 °C避光染色30 min。
加入500 μl 1x FACS缓冲液终止染色反应，洗掉残余的抗体。
加入200 μl BD Cytofix/Cytoperm缓冲液重悬细胞，4 °C，避光固定30 min。
加入500 μl 1x BD Perm/Wash缓冲液用 (将1x BD Perm/Wash缓冲液用ddH2O稀释至1x即可)，4 °C，840 x g离心2 min弃掉上清。
重复步骤6.
加入20 μl用1x BD Perm/Wash缓冲液稀释的T-bet以及其它细胞内荧光标记抗体如CTLA4、Ki-67、Bcl-2等混合液，重悬细胞，室温避光染色1~2 h。
注：染色过程中应没隔15 min左右用拇指弹一下管底，使得细胞更充分的接触抗体。
加入500 μl 1x BD Perm/Wash缓冲液，4 °C，840 x g离心2 min弃掉上清，以洗掉残余抗体。
加入300 μl 1x BD Perm/Wash缓冲液重悬细胞，用200目白色尼龙网过滤细胞至流式管中。
流式细胞术检测细胞荧光表达情况。
注：流式上机检测之前一定要使用200目白色尼龙网过滤细胞以除去死细胞以及细胞碎片，否则容易堵塞流式细胞仪管道。
结果与分析
流式结果分析
Treg细胞的亚群分类 (依据来源分类)
1)
胸腺来源的tTreg：CD4+CD8-Foxp3+GFP+Nrp-1+Helios+
2)
外周诱导形成的pTreg：CD4+CD8-Foxp3+GFP+Nrp-1-Helios-
Treg细胞的亚群分类 (依据活化状态分类)
1)
静息状态的Treg (cTreg)：CD4+CD8-Foxp3+GFP+CD44loCD62LhiCCR7hi CD25hiBcl-2hiICOSloKLRGloCTLA4loKi-67lo
2)
活化状态的Treg (eTreg)：CD4+CD8-Foxp3+GFP+CD44hiCD62LloCCR7lo CD25loBcl-2loICOShiKLRGhiCTLA4hiKi-67hi
特化Treg细胞亚群 (依据转录因子表达的不同)
1)
Th1-Treg: CD4+CD8- GFP+ (Foxp3+) CXCR3+T-bet+
2)
Th2-Treg: CD4+CD8-Foxp3+GFP+GATA3+
3)
Th17-Treg: CD4+CD8-Foxp3+GFP+ RoRγt+
4)
TFR: CD4+CD8-Foxp3+GFP+CXCR5+Bcl6+
溶液配方
1x ACK红细胞裂解缓冲液
15.5 mM氯化铵 (NH4Cl)
1 mM碳酸氢钾 (KHCO3)
0.01 mM乙二胺四乙酸 (EDTA)
pH = 7.2~7.4
0.22 μm无菌滤膜过滤
4 °C保存
1x PBS缓冲液
136 mM氯化钠 (NaCl)
8.2 mM磷酸氢二钠 (Na2HPO4)
1.5 mM磷酸二氢钠 (NaH2PO4))
2.7 mM氯化钾 (KCl)
pH = 7.2~7.4
4°C保存
1x FACS缓冲液
1x PBS缓冲液中加入
0.2%牛血清白蛋白 (BSA)
0.01%叠氮钠 (NaN3)
4 °C保存
4% PFA (多聚甲醛) 固定液
400 ml ddH2O + 250 μl 1 M氢氧化钠 (NaOH)
加入20 g多聚甲醛粉末
加热至65 °C~70 °C，搅拌溶解
冷却至室温
加入50 ml 10x PBS缓冲液
用ddH2O定容至500 ml
用盐酸 (HCl) 调PH至7.3
0.22 μm无菌滤膜过滤
4 °C避光保存
单细胞悬液
500 ml DMEM
10 ml胎牛血清 (FBS)
250 μl氨苄西林钠 (0.25 g/ml)
250 μl硫酸链霉素 (0.25 g/ml)
抗体溶液
每100 μl体系应该加入抗体的量
0.5 μl CD4-PercP-Cy5.5 (0.2 mg/ml)
0.5 μl CD8α-AF700 (0.2 mg/ml)
0.5 μl Neuropilin-1-Biotin (0.2 mg/ml)
2 μl Streptavidin-APC (0.2 mg/ml)
0.5 μl CD44-APC (0.2 mg/ml)
0.5 μl CD62L-PE (0.2 mg/ml)
1 μl ICOS-APC (0.2 mg/ml)
1 μl KLRG1-APC (0.2 mg/ml)
2 μl CCR7-PE (0.2 mg/ml)
1 μl CD25-PE (0.2 mg/ml)
1 μl CXCR5-APC (0.2 mg/ml)
2 μl Foxp3-BV421 (0.2 mg/ml)
2 μl Helios-PE (1.5 μg/ml)
2 μl CTLA4-PE (0.2 mg/ml)
1 μl Ki67-eF660 (0.2 mg/ml)
0.5 μl Bcl2-AF647 (5 mg/ml)
3 μl T-bet-PE (0.2 mg/ml)
3 μl GATA3-PE (0.2 mg/ml)
4 μl IRF4-eF660 (0.2 mg/ml)
3 μl RoRγt-APC (0.2 mg/ml)
1 μl Bcl6-PE (0.2 mg/ml)
致谢
此实验方案主要基于周旭宇研究员之前的研究工作以及其实验室最近发表的文章 (Zhou等，2009；Zhang等，2017；Zhu等，2019)。在此致谢张伟博士、张忠美博士对本实验方案的贡献。本项工作得到了国家自然科学基金项目 (项目编号：31470882，31870911)和国家科技重大专项的资助 (项目编号：2016ZX10004222-007)。
参考文献
Cretney, E., Kallies, A. and Nutt, S. L. (2013). Differentiation and function of Foxp3(+) effector regulatory T cells. Trends Immunol 34(2): 74-80.
Dominguez-Villar, M. and Hafler, D. A. (2018). Regulatory T cells in autoimmune disease. Nat Immunol 19(7): 665-673.
Josefowicz, S. Z. and Rudensky, A. (2009). Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity 30(5): 616-625.
Josefowicz, S. Z., Lu, L. F. and Rudensky, A. Y. (2012). Regulatory T cells: mechanisms of differentiation and function. Annu Rev Immunol 30: 531-564.
Sakaguchi, S. (2004). Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 22: 531-562.
Smigiel, K. S., Richards, E., Srivastava, S., Thomas, K. R., Dudda, J. C., Klonowski, K. D. and Campbell, D. J. (2014). CCR7 provides localized access to IL-2 and defines homeostatically distinct regulatory T cell subsets. J Exp Med 211(1): 121-136.
Zhang, Z., Zhang, W., Guo, J., Gu, Q., Zhu, X. and Zhou, X. (2017). Activation and Functional Specialization of Regulatory T Cells Lead to the Generation of Foxp3 Instability. J Immunol 198(7): 2612-2625.
Zhou, X., Bailey-Bucktrout, S. L., Jeker, L. T., Penaranda, C., Martinez-Llordella, M., Ashby, M., Nakayama, M., Rosenthal, W. and Bluestone, J. A. (2009). Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in vivo. Nat Immunol 10(9): 1000-1007.
Zhu, X., Zhang, W., Guo, J., Zhang, X., Li, L., Wang, T., Yan, J., Zhang, F., Hou, B., Gao, N., Gao, G. F. and Zhou, X. (2019). Noc4L-Mediated Ribosome Biogenesis Controls Activation of Regulatory and Conventional T Cells. Cell Rep 27(4): 1205-1220 e1204.
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