Western Blot的原理
自1979年被建立以来，蛋白印迹已成为研究型实验室的一种常规方法。Western Blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。包含通过凝胶电泳来分离蛋白混和物，随后电转移到适当的膜（如PVDF）上。在蛋白转移至PVDF膜后，它们可被染色以便观察。被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗及底物。通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。这种方法能够提供各个蛋白的分子量信息，并能区分异构体、选择性加工产物及其它的翻译后修饰形式。
Western Blot的流程
实验器材
操作步骤——1. 样品制备
对于Western Blot实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。提取过程中为保证蛋白的完整性还可以加入蛋白酶或磷酸酶抑制剂。
准备进行western blot的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。样品为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性对其进行提取。根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。
贴壁细胞样本的总蛋白提取
倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
于4 ℃下12000rpm离心5 min。（提前开离心机预冷）
将离心后的上清分装转移倒0.5 ml 的离心管中放于－20 ℃保存。
哺乳动物组织样本的总蛋白提取
将100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS 洗涤两次后，4℃，700×g（3000 rpm) 离心3 min，弃上清。20 mg组织加入100 μl裂解液，置玻璃匀浆器冰上均质30～50次。(如使用组织匀浆机，则按照20 mg组织加入100 μl裂解液的比例加入裂解液。每个试管加入2个直径2 mm的磁珠。将试管放入组织匀浆机中，60 HZ，300s。充分裂解后，10000 g离心5 min，取上清。)
最大速度涡旋震荡10 sec，冰上放置20 min，期间取出震荡3-5次,再于4℃， 12000 rpm 离心10 min，以沉淀组织或细胞碎片，取上清。
生工相关产品——WB样品制备
RIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA 裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的 WB、IP 等。按裂解强度可分成不同类型产品。
对于不同的物种组织、培养细胞或不同细胞结构蛋白，您可以选择更有针对性的试剂盒。如果您需要节省实验步骤，加快速度，还可选择一步法蛋白提取试剂盒。
对细胞进行裂解后，与目标蛋白一起释放出来的还有蛋白酶和磷酸酶，他们会水解蛋白为多肽或氨基酸。此过程会导致许多重要蛋白的流失，进而严重地影响下游实验，因此需要在细胞的裂解过程中加入相应的蛋白酶或磷酸酶抑制剂，从而确保目标蛋白的完整性。
未完待续~
联系客服
