其实看完这篇文献，最大的收获还是明白了直捣黄龙这个成语的正确含义，所以还是引用《左传-·曹刿论战》中“一鼓作气，再而衰，三而竭”更为合适，这也和现在多步方法制备多功能CAR-T的低效相吻合。
摘 要
通过不依赖tracrRNA的CRISPR-Cpf1结合AAV转导，能够一步高效的开发出同时敲入含CAR的同源指导修复模板（HDR）同时敲除PDCD1基因（编码免疫检查点PD-1）的CAR T细胞，即使KIKO CAR-T。
AAV-Cpf1的模块化操作可以在同个T细胞中敲入2个不同的CAR，相比基于Cas-9的方法，Cpf1-AAV可以更加高效的产生双敲入的CAR T细胞。
相比Cas9制备的CAR T细胞，AAV-Cpf1 KIKO的CD22-CAR T细胞有着更强的产生细胞因子和杀伤癌细胞能力，同时耗竭型标志物的表达水平更低。
这套多功能的体系使得T细胞的改造更加简化和精准。
所以对比CAR-T在生物学性质和生产中面临的挑战，这些新的技术平台应该也是可以解决关键痛点的，值得进一步深入的研究。
下面推送全文，较长，多图费流量。
研究背景
实验方法及材料
实验结果
1 AAV-Cpf1可以有效的进行多重基因编辑
2 AAV-Cpf1可以同步敲入和敲除
3 一步制备敲除PDCD1的CD22 CAR-T细胞
4 模块化制备靶向CD19和CD22的双特异性CAR-T细胞
5 AAV-Cpf1 KIKO和Cas9介导制备的单/双敲入CAR-T细胞之比较
6 单/双敲入制备CAR-T细胞的免疫特征比较
7 AAV-Cpf1 KIKO和Cas9 RNP制备的CAR-T细胞的免疫特征比较
讨论
研 究 背 景
正是这些优点，研究人员在原代T细胞中开发了基于Cpf1的靶向多个位点的平台：采用电穿孔导入LbCpf1的mRNA和传输crRNA与HDR模板的AAV的组合（AAV-Cpf1），简便但高效通过HDR介导CAR敲入并敲除了免疫检查点（KIKO）。通过AAV-Cpf1平台产生的KIKO CAR-T在CAR 保留、杀伤癌细胞、效应功能和耐耗竭等方面有着诸多优势，使得可以通过模块化的加工、简化复杂的T细胞基因改造流程来高效的制备更有效的CAR-T细胞。
方 法 及 实 验 步 骤
LbCpf1-crRNA阵列分别靶向TRAC基因座的第1个外显子和PDCD1的第2个外显子，CD22BBz CAR包括特异性靶向hCD22的scFv m971、CD8铰链跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内结构域，而CD19BBz CAR中只是将scFv换成靶向CD19的FMC63，优化的实验流程如下图所示，其余略。
实 验 结 果
1 AAV-Cpf1可以有效的进行多重基因编辑
这些数据证明携带crRNA阵列的AAV6载体外加电穿孔转入LbCpf1 mRNA能够在人原代T细胞中进行有效的多重编辑。
2 AAV-Cpf1可以同步敲入和敲除
这些结果表明：AAV-Cpf1通过crRNA阵列和HDR供体可以简易、高效并精准的对人T细胞进行基因双敲入。
3 一步制备敲除PDCD1的CD22 CAR-T细胞
这些数据表明采用AAV-Cpf1 KIKO系统能够一步就简便快速的敲入精准靶向的CAR的同时敲除免疫检查点。
4 模块化制备靶向CD19和CD22的双特异性CAR-T细胞
这些结果表明可以只需一步就可以模块化的制备CD22BBz和CD19BBz双敲入的同时破坏TRAC;PDCD1功能的工程改造T细胞。
5 AAV-Cpf1 KIKO和Cas9介导制备的单/双敲入CAR-T细胞之比较
尽管Cpf1和Cas9属于两种不同的核酸酶，两套体系也不能完全等价，但是这些数据显示目前来看AAV-Cpf1 KIKO平台能更有效的制备靶向内源性基因位点的双敲入CAR-T细胞。
6 单/双敲入制备CAR-T细胞的免疫特征比较
因此AAV-Cpf1 KIKO制备的不管是单敲入还是双敲入CAR-T对同源的肿瘤细胞都有着强效的裂解靶细胞和分泌细胞因子的功能。
7 AAV-Cpf1 KIKO和Cas9 RNP制备的CAR-T细胞的免疫特征比较
这些结果显示，AAV-Cpf1 KIKO平台能以更加简便的基因传递方式制备更强效应功能的CAR-T，同时降低了耗竭程度，特别是在制备双敲入CAR-T细胞时这些优势更加明显。
综合上文的制备效率数据，提示AAV-Cpf1 KIKO系统可以快速高效的制备多功能的CAR-T细胞，同时兼具精准靶向和模块化特征。
讨 论
对免疫细胞如T细胞进行基因工程改造能够有效地在不同位点实现多个基因导入，能广泛应用于原代T细胞功能研究和突变表现特征分析，例如能根据编码检查点、主要调控因子或先前未知靶点的关键基因快速检测天然或者改造的T细胞的免疫特征。多重KIKO能用来在免疫细胞种建立不同的报告基因或者构建逻辑网络来分析内源表达和信号通路。KIKO系统除了应用在T细胞外，还能广泛应用于其它多种免疫细胞，例如HSC、DC和巨噬细胞。这些改造的免疫细胞的过继转移研究促进了对动物疾病模型（如病毒感染、免疫紊乱和癌症）中病理和治疗应答的理解。
作为“活的药物”，基因工程改造的CAR-T具有强效特异的抗肿瘤活性，已经成为最有前景的疗法。但是目前只有Yescarta(axicabtagene ciloleucel)和Kymriah (tisagenlecleucel)两个CAR-T产品获得FDA批准治疗DLBCL和B细胞ALL。尽管在临床前和临床阶段又多种形式的CAR-T细胞在开发，但是还未获批治疗其它形式的血液肿瘤和实体瘤。CAR-T细胞的制备包括：原代T细胞分离、基因转入和扩增，其中转导效率、转入基因表达水平和CAR的稳定及保持都是这个过程的关键。尽管如此，在慢病毒或者逆转录病毒转导中，CAR-T细胞通常会渐渐丢失转入的基因从而失去识别并杀伤癌细胞的能力。CRISPR-Cas9介导的在TRAC位点的定点敲入可以提升CAR-T细胞的稳定性和功能。KIKO系统所用的AAV载体上携带了可以灵活的多重编辑的Cpf1 crRNA阵列和用于导入CAR的HDR片段，有着重要的优势。这套系统可以便利的扩展成高维CAR-T改造，像用2个CAR分子实现双靶向，或者导入调控蛋白（自动调控基序、自杀开关、效应增强器或阻滞剂）。
由于AAV-Cpf1 KIKO CAR-T 有着高效、快速扩增和自动富集的特点，因此常规采血通过一系列AAV电穿孔并体外扩增2周就能制得3X108CAR-T细胞（临床输注的典型剂量）。尽管本研究对CAR-T工程改造的早期步骤有一定改进，但是在未来开展临床研究前还需要对毒性谱和体内疗效做严格评估。未来假以进一步优化并做好体内检测，这个简便且可模块化的平台，在T细胞工程化改造中有着广泛应用的潜力，比如改进临床上的通用型（‘off the shelf’）过继细胞疗法。
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