第一次涉及以前大学时候学的最菜的神经生理，希望大家轻点吐槽，给在下留几分薄面。
今天涉及的内容类似之前看球时的段子，只取表面意思，载体上的基因换个顺序，就像某些球员场上换个位置就迎来巅峰一样，真的不是嘲笑以前阿仙奴买不起人。
axovant在日前披露了从Oxfordbiomedica引进的AXO-lenti-PD(OXB-102)治疗帕金森病的一些早期数据，下面简单介绍下。
简要目录
1 PD的治疗现状及基因治疗的可行性
2 ProSavin简介
3 初出茅庐——ProSavin的临床结果
4 ProSavin的优化
5 重踏征程
6 AXO-Lenti-PD的初步结果
1 PD的治疗现状及基因治疗的可行性
帕金森症（PD）是一类常见的神经退行性疾病，常见特征是运动功能障碍导致的运动迟缓、僵硬、震颤、步态损伤和姿势不稳定性。常见于60岁以上老年群体，发病率约1%，大约影响全球700-1000万人。
PD中最关键病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，从而引起纹状体多巴胺的含量显著降低，具体病因尚不明确，遗传（占5-10%）、环境（如杀虫剂等化学物质暴露）和年龄等诸多因素都有可能参与此变性过程。
多巴胺的生物合成效率通常由黑质神经元中表达的3个关键酶限制：其中酪氨酸羟化酶(TH)促进酪氨酸转化成左旋多巴，GTP环水解酶1(GTP-CH1/CH1)催化产生的四氢生物素(BH4)是调节TH活性的关键辅助因子，而芳香氨酸脱羧酶(AADC)进一步催化将左旋多巴转化成多巴胺。其中TH和CH1还通过物理上的直接相互作用，引起两者的酶活性均有提升，同时也避免了CH1被终产物的负反馈调控。
下图是号称17年全球主流的帕金森治疗药物及市场分额，盗图自IQVIA：
可以看出DR激动剂罗替戈汀、阻断多巴胺酶降解的雷沙吉兰和两种复方左旋多巴占了3/4的分额，这些治疗药物多数是恢复脑内的多巴胺水平并控制病情。但是一旦疾病进展，这些药物就会变得无效，表现为“开-关现象”【即病人在治疗时因为多巴胺水平恢复会有较明显的治疗效果且运动能力改善（开），但突然会无征兆的运动能力减退（关）】和运动功能障碍。有研究表明，长期治疗中断断续续的刺激多巴胺受体以及药物的脱靶效应会引起运动并发症和偶然性的冲动控制障碍。因此需要有新的疗法可以只局限在多巴胺缺失的纹状体部实现持续稳定的多巴胺替代，能够提供长期有效的治疗而没有相应的并发症。
转基因能够带来治疗型蛋白在体内的长期表达，先前有几个研究在体内评估了用AAV载体治疗PD的可行性，各自转移了旨在神经保护的神经营养因子neurturin、增强从左旋多巴到多巴胺转化的AADC和调节基底神经元活性的谷氨酸脱羧酶的编码基因。所有基于AAV的基因治疗都安全可耐受，并且在临床上的运动评估中都显示了一定的获益。而慢病毒载体的一些体内数据显示相比AAV有着更低的免疫原性，同时在转导神经元细胞时可以有更高的效率并且在更长的编码基因。
另外一点需要指出，目前基因治疗的设计还不是完全取代口服左旋多巴，而是通过稳定产生内源性多巴胺来减少运动障碍，延长on time(非失能时间：每天帕金森患者左旋多巴药物持续最优疗效且不出现运动障碍的时间)、缩短off time(失能时间：每天左旋多巴药物失去最优疗效并且帕金森症状反复的时间)，最终降低外源性的左旋多巴摄入。
2 ProSavin简介
Oxford Biomedica开发了基于EIAV（马传染性贫血病毒）开发的三顺反子慢病毒载体ProSavinTM，可以同时编码多巴胺合成的三个关键酶，即：TH、CH1和AADC。有人将携带上述三个基因的多顺反子EIAV载体转入纹状体神经元这类非多巴胺能细胞中，发现三个基因持续表达并生成多巴胺，同时也显著降低了PD模型大鼠的不对称运动，改善了运动机能。因此ProSavin治疗原理就是将载体运输到纹状体部位将纹状体细胞转化为“生产多巴胺的工厂”，实现对PD患者中缺失的那部分多巴胺的替代治疗。
那么为什么不用逆转录病毒呢？主要还是基于安全性考量，临床上使用γ逆转录病毒修饰造血干细胞时发现整合型载体可能会引起插入突变，慢病毒在设计上就通过移除LTR的病毒控制信号减轻了插入突变的风险从而降低潜在的基因激活。ProSavin主要靶向有丝分裂后的神经元细胞，降低了肿瘤发生的风险；同时慢病毒更倾向整合入活动的基因因而插入原癌基因的可能性较低；再者ProSavin转移的基因都没有增殖优势，这些证据足以表明使用ProSavin引起肿瘤发生的风险极低，也没有发现插入突变。
在非人灵长目的PD模型的临床前研究中，研究人员向纹状体注射ProSavin，结果安全可耐受，细胞外多巴胺浓度提高，并且在12个月内对运动障碍综合症有明显纠正。
3 初出茅庐——ProSavin的临床结果
研究人员在法国和英国的2个中心开展了研究在晚期PD患者的双侧纹状体注射ProSavin的安全性、可耐受性和疗效的1/2期临床。所有的患者入组到各自独立的开放标签的长期安全随访研究，分离的队列评估低中高三个剂量（对应1.9X107TU、4.0X107TU和1X108TU）。入组标准包括：年龄48-65岁、疾病持续时间≥5年、统一帕金森评定量表第三部分(UPDRSIII)的off medication评分20-60、左旋多巴治疗相关的运动综合症、口服治疗后≥50%的UPDRSIII评分改善。主要临床终点是ProSavin治疗相关的不良事件数量及严重程度，以及UPDRSIII的off medication评分测算的ProSavin注射6个月后的运动反应。
最终15名患者接受了治疗并进行随访，其中低剂量3人(Cohort 1)，中间剂量(Cohort2a和2b)和高剂量(Cohort3)各6人，其中Cohort2b的3人和Cohort3均采用改进版的载体输送方法以期提升分布。
在治疗后的首个12个月的随访后，共报道了54例药物相关的不良事件（51例轻微，3例中度），最常见的是on-medication的运动障碍增加（11名患者，20例事件）和开-关现象（9名患者，12例事件），没有和药物或手术相关严重不良事件报道发生。
治疗后UPDRS III的offmedication运动评分（mean[SD]）相比基线有显著降低，其中在6个月： 26 [8] vs 38 [9] (n=15, p=0·0001) ； 12个月：27 [8]vs 38 [9] vs (n=15, p=0·0001)。
另外UPDRS II和IV部分在治疗后6个月相比基线也有统计学意义上的显著改善：
A significantdecrease in mean scores at baseline and 6 months was also noted in the UPDRSpart II assessments (off state: 21 vs 17; n=15, p=0.02; on state:4.2 vs 2.2; n=15, p=0.02).
UPDRS part IV scoreswere improved relative to baseline in ten of15 patients at 6 months and 11 of 15 patients at 12 months with a significantreduction in mean score between baseline and 12 months (10 vs 8; n=15, p=0.03).
2018年发表了该研究的8年长期随访结果：
安全性方面：共有2例死亡，但是与ProSavin或PD疾病都无关。一共发生96起ProSavin相关不良事件，其中轻微87、中度6、严重3，可见绝大多数是轻度AE，在治疗后的第1年就已经发生。最常见的依旧是运动障碍增加（11名患者，33例事件，其中轻度30、中度2、严重1）和开-关现象（11名患者，22例事件，全部为轻微），其中前者可以通过降低口服药物来缓解，各个队列之间的安全谱无差异。
疗效：和治疗后6个月及12个月测算报道的结果一致，在第2年的时候UPDRSIII的offmedication运动评分相比基线也是显著降低 (29 [2] vs. 38[4], n = 14, p < 0.05)，在可评估的14名患者中有10人显示了相较于基线的持续改善，同时各个不同的剂量组之间没有显著差异。尽管在第3和4年的时候分别有4和5名患者退出了有效性分析，但是依旧10/11和8/10的患者展示了相比于基线的UPDRS III的offmedication运动评分的显著改善；进一步随访至第5和6年，持续UPDRSIII运动评分改善的患者分别6/9和4/6。
有一点与12个月时候不同，在第2年评估的UPDRS II和IV评分相较基线没有显著差异。
所以这些数据证明了ProSavin治疗PD的安全性和潜在的疗效，并且可以在治疗后5年依旧可以在接受评估的大部分患者中持续，但是整体上疗效还是偏中度。多巴胺替代治疗的目的还没有完全实现，所有的患者都需要进行口服左旋多巴治疗以获得最大疗效——尽管整体上每日剂量有下降趋势。
这样的数据到了安慰剂对照的临床中是不是还有显著差异和临床意义？之前用AAV载体基因治疗PD的早期结果也是令人振奋，但是到了安慰剂对照的2期，就几乎没有做出显著结果。所以开展后续临床前，需要对ProSavin做进一步的优化，最重要的就是优化3个转入的基因的表达。
4 ProSavin的优化
在载体设计上，TH基因紧随在CMV启动子后，后面再是AADC和CH1基因，3个基因之间用EMCV和脊灰病毒的IRES序列间隔，这个多顺反子的表达框架经过体外试验的验证可以最大化多巴胺的生成。有研究表明多单个多顺反子上，IRES介导的第2或3个基因的翻译效率远远低于启动子控制下的第一个基因，同时IRES复杂的二级结构可能也会影响反转录的效率降低病毒载体的滴度。
所以后续的优化工作是尝试改变ProSavin的表达框架上的基因顺序并用linker将2-3个基因融合在一起，用一个组成型的启动子驱动2-3个基因表达，试图来提升病毒转染的细胞中多巴胺及其前体左旋多巴的产量。
发现在HEK293T细胞中，用富含GS的15个氨基酸组成的linker将TH和CH1串联在一起、AADC紧随其后并用IRES间隔的构造（TCiA），相比ProSavin可以在相近的滴度下(图略)产生显著更多的多巴胺和左旋多巴(p<0.05，其中多巴胺的产量提高5倍)；进一步和其他形式的改造比较，TCiA也是唯一相比ProSavin多巴胺和左旋多巴产量都显著提升的形式。
进一步在转化更能验证临床效果的细胞——人原代神经元的研究中， EIAV-TCiA相比ProSavin有着更强的生成多巴胺和左旋多巴的能力，普通293细胞中的结果得到了重复。而组化分析也在大鼠纹状体中确证了EIAV-TCiA转入的生成多巴胺的所必需的这3个关键酶的表达。
这些临床前的证据表明新设计的EIAV-TCiA相比先前的ProSavin有着更强的多巴胺生成能力，当然进入临床之前还需要进一步的验证有效性和毒性，也要分析生物分布、免疫反应和安全性，这里不再介绍，因为有些实在找不到。
5 重踏征程
2018年6月OxfordBiomedica宣布与Axovant就开发OXB-102/AXO-lenti-PD治疗PD等所有indication达成了排他性的全球合作协议。
根据描述应该是EIAV-TCiA无疑：通过将原本在启动子后第三个表达的CH1前移紧随TH后的linker保证两个基因表达产生的蛋白量接近1:1，这样转化的细胞和ProSavin相比产生的多巴胺量及其前体左旋多巴都显著提升。
2018年10月25日完成了首例患者给药。
6 AXO-Lenti-PD的初步结果
首个剂量组（4.2X106TU）2名患者给药后进行了3个月的观察，关键终点包括了前文所提的安全性和可耐受性、UPDRS III的off medication运动评分、RDRS评分、Hauser临床受试者日记。
安全性结果一带而过，依旧无sAE。根据DMC的反馈，计划2019Q2开始下一剂量组的给药（1.4X107TU）。
下面来看UPDRS III的offmedication运动评分，本次研究的基线是58-60，而之前PeoSavin治疗的3个Cohort是38[SD,9]且评分最高的只有两例52，所以这次的疾病状态是更严重，当然样本也更小。
相比基线UPDRS III的offmedication运动评分的改善好于之前的AAV载体（Sharm1/2）ProSavin。这里依旧需要指出AAV和ProSavin的研究中都是6个月的观察结果，另外还是老话题—sample size。
这里不看样本大小的话，间接比较，相比基线AXO-Lenti-PD治疗后3个月的UPDRSII和IV评分的改善也好于ProSavin治疗后6个月的改善。
这里有个关键点，LEDD下降了20%，简单粗暴的对比ProSavin的结果：6个月和12个月的时候剂量下降9.5%和14.8%。
从PD的基因治疗的目标角度，改善运动功能和降低运动障碍都是达到了。
即将开展下一剂量的研究。
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另外争取上半年有时间把这篇文章看下
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