前段时间曾经给大家介绍过组织、细胞中提取蛋白质的基本方法、注意事项及在选择不同类型裂解液时,结果出现的偏差。在提取蛋白的时候,总发现提取的蛋白量很少,这样就得好好排查下每个环节可能出现的问题,尤其得考虑,裂解液是否合适?
接下来,跟大家聊聊挑选WB内参的那些事!
首先,先了解下,WB实验中,内参的主要作用:
(1)第一点:主要起到校正作用,在蛋白样品定量及上样过程中产生的误差,在内参参与条件下以保证实验数据的准确性。
(2)第二点:就是可作为空白对照,检测蛋白转膜是否完整及发光显色是否正常!
其次,进入今天的重点话题,如何挑选WB内参?挑选蛋白内参是非常有讲究的,现在给大家一一列取下:
(1)首先,要看你研究样本的种属性,研究动物、人、植物的内参选择有天壤之别!
(2)其次,需要考虑目的蛋白分子量大小,其中内参与目的蛋白分子量大小有一定的差距,一般为相差5KD以上,这个具体情况具体选择。
(3)接着就是蛋白表达部位差异问题,不同细胞器中蛋白检测,挑选内参也有差别。如:全细胞/细胞质中的内参有以下几种供参考:β-actin、GAPDH、α-actin、β-tubulin及vinculin等等;细胞核:LaminB1、HDAC1、PCNA等等;线粒体:VDCA1、porin等;内质网:calreticulin 溶酶体:LAMP2等等。其实还有很多,大家非常感兴趣可以专门查找相关文献阅读阅读。
(4)最后,也是最重要的内容——得考虑实验处理条件对内参的影响问题,如:研究糖酵解过程中的蛋白,特别典型的就是糖尿病类疾病,这样就不可在选择GAPDH作为内参了,因为GAPDH是糖酵解过程中重要的酶!还有还有,缺氧内实验,也千万不能选择GAPDH作为内参。除了这些,经过在实验和理论中探讨,对比了不同内参的实验结果,还发现做细胞毒性实验,不可选择TATA binding protein和Lamin B作为内参,会直接影响实验结果。
那么WB造假都有什么花样?
如何判断获得的WB图片有造假嫌疑?
我们前期该做些什么准备才能避免WB图片遭到质疑?
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