关于WB、RT－PCR、流式等实验所需细胞数的相关问题解答

1、流式所需细胞数

1）问：我目前准备做流式，要做 10 个标本，但是细胞总数不多了，我能不能把原来在100ml 培养瓶培养的细胞转移到 25ml 里培养，这样把细胞重悬后，1 个 100ml 的可以分到 4 个 25ml 里。请问这样可以吗？细胞数够吗？据说做流式至少要10⁵次方个细胞以上才行。

答：细胞数是够的，请问你用流式测什么指标，用不用其他药物处理，说得详细点方可知你的方法妥不妥。

2）问：我要用流式测细胞周期，要加抑制细胞增殖的药物，然后自加药的不同时间取样测细胞周期。这样可行不？

答：抑制率大概多少？那就建议您至少用 50ML 的培养瓶。

3）问：请教大家一个问题：因为我做流式需要做很多次，就想到用六孔板做，六孔板的一个孔内的细胞数够不够做一次流式用？

答：足够了， 流式标准一个指标需要 1X10⁵。我做过，没有问题。

4）问：因为我做流式需要做很多次，就想到用六孔板做，六孔板的一个孔内的细胞数够不够做一次流式用？有没有人用过这个方法？

答：足够了！流式检测所需的细胞的数量级10⁵，而六孔板长满能达10⁶。

5）问：请问用 96 孔板作的转染可以做流式细胞仪分析么？做流式细胞仪分析要用多少微升的悬液？

答：一般我们使用 500 微升的悬液上机检测！

6）问：请问流式检测的最小的细胞数量是多少，如果小于一个细胞的话是否就不能采用流式检测了。流式要求的细胞的最小体积是多少，我最近收集了少量细胞团，30-50 微米，因为将细胞团中的各个细胞分离开较难，是否可以用于流式的检测？

答：如果不能将细胞分散成单个细胞悬液的话是无法用流式细胞法分析的；检测时最少要有 2000 个细胞，但最初准备样品时，如果只做外标，样品比最少细胞数大一个数量级即可；但要是需要作内标的话，固定液和穿膜液粘度大，细胞损失也多，而且，穿膜液一般对细胞还有损伤，故样品细胞数要比最少细胞数大 2 个数量级！做流式，细胞必须是单细胞悬液，成团细胞可用胰酶处理，或是在细胞样品中加 2mM 的 EDTA，防螯合。

7）问：请问流式检测的最小细胞数是多少？如分离出两种细胞，一种细胞数很少，但体积很大，另一种细胞是其数量的 10-20 倍，是否可以用流式同时检测呢？

答：记得有人研究用针头取样后进行流式分析的文章，所以细胞数应该是可以很少的.在大量细胞中检测低频率事件（即你例子中的第一种细胞）正是流式的优点.关键是你的第一种细胞在大小，密度或荧光标记上和其他大量细胞有区别，并且细胞团能用酶解或机械方法处理成单细胞悬液。

8）问：流式能检测含多种细胞的标本吗?细胞碎片影响流式检测效果吗?怎样在检测前去除细胞碎片?

答：能检测含多种细胞的标本因为流式本身能根据细胞的大小及细胞内容物颗粒大小（即所谓的流式仪所用的前向光和侧向光）来区别不同的细胞群而通常做研究时是荧光标记你感兴趣的亚群进行分析含有碎片会有一点点影响，但用空白样品（未作任何荧光标记的样本）选定你想研究的细胞群体时，即可排除细胞碎片，因为碎片所反映的前向光和侧向光和完整的细胞基本不相同 。

2、Western 和 RT-PCR 所需细胞数

1）问：我是实验新手，拟在细胞上行 WB 和 RT-PCR，由于实验基础太差，不知道细胞水平行 WB 和 RT-PCR 所需多少细胞，一般用多大的板子培养才能提足所需蛋白和 RNA？

答1：我做过 WB 的，细胞数目要达到10⁶个，这样提出的蛋白就可以了！因此一般的六孔板就可以了！24 孔板，96 孔的感觉有点小了，空间太小细胞长就不好了！先前要计个数的，然后进行蛋白定量的！悬浮的就直接离心得沉淀，裂解得蛋白的就可以了，贴壁的要用到细胞刮子。RT-PCR 就不太清楚了。

答2：看你要养的细胞是哪种了，有的细胞的体积就很小，而有的细胞则铺得很开。做 RT－PCR 用两步法即先抽 RNA 经反转录再做 PCR 一般要用到 1ug 的总 RNA。（1ug 经反转录成 20ul 体系后一般可做至少 50 次 20ul 体系的 PCR）常规做 WB 一个孔道上样要10⁵个细胞。但也和你的目的蛋白及提取的方式有关。如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。你最好和你们实验室做过相关实验的人讨论一下。

2）问：我初次作 RT-PCR 和 Western，请教要使用多少转染后的细胞呢？转染效率是多少？瞬时转染是否可以传代呢？对检测有多大的影响？

答：一般转染效率达到 50% 的话，一个 24 孔班板的细胞足够做 RT-PCR 和 Western 了，你可以做一个 6 孔板转染或 2 个 24 孔细胞转染.瞬时转染可以传代，但传代后所转染的细胞会越来越少.你传代的目的是什么?如果想稳定表达的话，你应该作稳定转染。

3）问：你的“一般转染效率达到 50% 的话，一个 24 孔班板的细胞足够做 RT-PCR 和Western 了”是不是可以这样理解：转染效率 50％，24 孔板上每个孔均长满细胞。一半细胞用作 RT-PCR ，另一半用作 Western。再弱弱的问：是刚好够吗？您的建议：你可以做一个 6 孔板转染或 2 个 24 孔细胞转染。24 孔板 2 个是为了保险。那 6 孔板是？？

答：转染效率 50％，24 孔板上每个孔均长满细胞。一半细胞用作 RT-PCR ，另一半用作 Western 足够用了。做 2 孔是其中一孔做 RT-PCR ，另一孔做 Western，这样操作起来比较方便，一个 24 孔板上的细胞够你做几次Western了。如果用 6 孔板，你只转染一个孔就可以，看你喜欢哪种了。

3、MTT细胞数问题

1）问：本人准备做 SKOV3 和 SMMC-7721 的 MTT 实验，请问 MTT 实验中 96 孔板中的合适细胞数或者浓度？

答：调整细胞浓度至 1×10⁵/ml，分别加入 96 孔板，每孔加200μL 使每孔细胞数目是 2×10⁴个。

2）问：各位在做 MTT 时，如何尽量保证各孔细胞数基本一致？混匀细胞所用容器是培养皿还是储液器？储液器用的是一次性的还是可重复使用的？

答：MTT 检测时各孔细胞数的均一可比是关键。首先要保证收集细胞的分散混匀，贴壁细胞要消化完全，悬浮集落细胞团块要吹散充分，最好显微镜下观察确定。其次微量取液操作要规范、稳定，建议选用精密度较高的微量移液器和质地优良的 Tip 头。至于混匀细胞的场所是选择培养皿还是储液器，抑或其它容器，应该没有很大的影响，只要方便操作且不影响细胞活力即可灵活选用。额外补充一句，MTT 检测结果的影响因素除上面提及的方面外，每孔接种细胞的密度也是保证获取有意义和正确结果的重要一环，具体的接种细胞密度要根据不同的实验目的和观察效应的差异进行调整、确定。

3）问：请问做 MTT时，96 孔板中每孔的细胞数是多少啊?为了照相每次我都在加 MTT 前将扳子的培养液甩掉，照完相后加70微升的无血清培养液（为了节省）和 20 微升的MTT，不知道这样对结果有没有影响?

答：不同的细胞，不同的药物作用时间或是影响因素，要求接种的细胞数会不同。一般是 1000-10000 个，看你的细胞的生长速度，体积大小，都会有影响的。我做的几个不同的肿瘤细胞系，多数种 3000-5000 个，药物作用 48-72 小时是可以的，细胞数太少，读数太低，误差会增大。细胞数太多，细胞长满了以后脱落，OD 值和活细胞之间就不再是线性关系了，也会使结果失真。我们这里也有人种 1000/孔，但我试过 2500/孔，作用 48 小时，OD 值就特别小了。MTT 的影响因素太多了，还要自己好好摸索！

转自：体外诊断IVD知识库