之前我们介绍过，关于circRNA研究如何发5分文章。
在该文章中，作者的研究思路是首先运用高通量测序技术筛选出目标circRNA2837，之后建立动物模型来验证circRNA2837对脊髓神经元诱导自噬的调控，又设计了circRNA2837敲除实验和组织学实验进行验证，最后对其靶基因进行验证。
那今天我们来介绍另一篇关于circRNA研究的文章，看看该文章研究思路与上一篇文章有何不同之处。
这是一篇关于circRNA与结肠癌结合的研究论文，我们来看下作者都做了哪些内容：
1、首先作者运用RNA测序技术筛选出一些序列进行研究，这些序列均是与细胞周期调控(CCNB1和CDK13)、信号转导(PLCE1和USP3)、表观遗传调控(KDM1A和KMT2E)或转录调控(FOXK2和BMP2K)等有关，又因CCDC66基因的生物学功能暂未被报道，故选择此基因作为研究对象。
2、接着作者发现在大肠(Caco-2、HCT116、HT-29、LS123)、乳腺(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468)、胰腺(BxPC-3、MIA PaCa-2)和宫颈(HeLa)癌细胞中circCCDC66均有表达，且在缺氧条件下，linear CCDC66转录本水平显著降低，而circular CCDC66转录本水平保持不变，这表明在肿瘤内复发性缺氧应激可能会导致circCCDC66水平的积累，且circular RNA的稳定性可进一步增强肿瘤内缺氧应激。
3、接下来作者讨论了在结肠癌发生过程中升高的CIRCCDC66潜在的临床病理学意义，发现在癌前息肉组织和肿瘤组织中，circCCDC66水平均升高，且在大肠癌各期组织中，较其配对的非癌组织，circCCDC66水平均升高。结合生存曲线，发现circCCDC66表达水平可作为结直肠癌的良好预测生物标志物。
4、接下来作者进行了circCCDC66对细胞的功能验证，研究人员设计了两个具有反向剪接点的siRNA，成功敲除circCCDC66，发现可显著抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。
5、circCCDC66的过表达显著增加了细胞集落数，BrdU掺入实验表明circCCDC66刺激了DNA的合成。
6、作者通过数据库预测筛选出与circCCDC66相互作用的miRNA，发现了99个相关miRNA，且作者对癌基因和肿瘤抑制基因进行了显著差异表达分析，结果显示有37.5%的癌基因与circCCDC66相互作用的miRNA有结合位点，只有23.5%的抑癌基因有相关结合位点。
7、接下来作者采用过表达和敲除基因的思路研究了几个候选癌基因的水平，发现DNMT3B、EZH2、MYC和YAP1的水平在circCCDC66过表达时显著上调，在敲除时又显著下调，而EFNA4和FGF9没有受到影响。
之后研究人员又开发了一种新的体外转录结合体内环化方法来验证circCCDC66作为miRNA sponge的作用，结果表明miR-33b、miR-93、miR-185三条被预测与circCCDC66具有结合作用的miRNAs被富集，另外，在circCCDC66过表达时，MYC（circCCDC66上调蛋白）的3'-UTR区活性增强。敲除circCCDC66后发现MYC mRNA表达显著减低。又进行恢复实验后则能回复MYC mRNA的水平。这些数据均表明circCCDC66能作为miRNA sponge来调控MYC的表达。
8、最后研究人员又构建动物模型进行了体内实验，结果表明在敲除circCCDC66后抑制了肿瘤在体内的生长。
整体来看作者的工作量还是挺大的，那研究思路与上一篇文章有什么不同呢？
两篇文章的共同工作就是通过高通量测序和生信技术筛选出目标circRNA，然后对其细胞功能进行验证，不同之处就是在上篇文章中，作者筛选出circRNA之后又接着对其相关蛋白结合进行研究，最后进行体内验证，而在本篇文章中，作者筛选出circRNA之后研究的是与其相关的miRNA之间的作用并进行体内验证，即miRNA sponge，这也是近几年报道最多的研究。
那这里给大家提供了关于circRNA研究的两个思路，同学们有没有什么想法呢？欢迎在评论区留言，大家一起来探讨。
(注：图片来源于文献)
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