1、研究背景、生物学问题
circRNA作为一种非编码RNA，在动物特别是人中的研究比较多，但在植物中的研究非常有限。植物中的circRNA是否和动物具有相同的特质、发挥相似的调控作用？文章以水稻Oryza sativa和拟南芥Arabidopsis thaliana为研究目标，进行了全基因组范围circRNA的鉴别，并对其特性进行了分析。
2、研究流程图
3、取材
采集水稻的根、拟南芥的叶片，分别去除rRNA之后进行RNA测序。
4、研究技术
RNAseq数据分析、PCR验证
5、研究过程
circRNA的鉴别
从NCBI下载水稻和拟南芥RNAseq数据（reads长度分别为101bp、100bp），利用Bowtie2比对到参考基因组，舍弃所有mapped的序列；对所有unmapped的reads，两端分别提取20nt后再次进行基因组比对（称之为anchorreads），确定anchorreads在基因组的位置，以此判断原始reads是否存在circRNAsplicing。
图1.circRNA鉴别流程图
（circRNA末端的anchorreads需满足比对到基因相反方向）
据此，在水稻中共鉴别到12,037个circRNA，拟南芥中鉴别到6,012个。其中比例最高的为exoniccircRNA，即来源于外显子的circRNA。另外有较大比例的circRNA来源于多个基因间的反式反向剪切（trans-backsplicing）。
表1. 水稻和拟南芥circRNA类型和数量统计
circRNA的验证
针对水稻中表达丰度最高的18个exoniccircRNA，分别设计一对convergent引物、一对divergent引物，分别利用反转录之后的cDNA和基因组DNA进行PCR扩增，然后利用电泳进行扩增条带的检测。18个circRNA中的10个得到验证。
需要注意的是，10个其他类型（intronic、intergenic等）的circRNA无一得到验证。
图2.circRNA验证示意图
（理论上对于circRNA而言，divergent引物可以利用cDNA扩增出条带，而利用gDNA扩增不出条带；对作为control的线性RNA而言，cDNA和gDNA都可以扩增出条带）
植物中circRNA具有保守性
有700个生成circRNA的parent基因在水稻和拟南芥中为直系同源基因，分别占各自parent基因的比例为12.2%、14.5%；考虑到两物种所用的组织部位不同、处理不同，这一比例相当高。并且有300对直系同源基因在相似位置生成了circRNA。这一结果表明，植物中的circRNA具有较强的保守性。
图3.水稻(上)、拟南芥(下)生成circRNA的示意图
circRNA相邻intron区域特征
exonic circRNA相邻的intron区域大小明显大于线性RNA的intron区域大小，这一结论与动物中研究结果一致。水稻、拟南芥circRNA相邻intron序列无保守性。但与动物circRNA相邻的Intron区域多为重复序列或反向互补序列不同，植物circRNA相邻intron区域中两类序列有限。这一结果暗示动植物中circRNA的生成可能采用不同机制。
CircRNA与其parent基因表达量正相关
有研究表明circRNA会利用顺式机制调控其对应parent基因的表达量。利用Pearson系数计算发现，在水稻的18个样品中，349对circRNA-parent基因表达量之间存在正相关，无一例负相关。而在动物研究中，二者之间表达量并无明显相关性。
6、结论
文章首次系统地进行了模式植物（水稻、拟南芥）全基因组范围circRNA的鉴别与验证，并就circRNA的一系列序列特征（parent基因序列、相邻intron序列）进行了探讨，发现植物中的circRNA存在一些显著不同于动物中circRNA的特征。
7、参考文献
Ye C Y, Chen L,Liu C, et al. Widespread noncodingcircular RNAs in plants. New Phytologist, 2015.
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