单细胞测序作为时下火热的测序技术，吸引了越来越多的科研人员。作为临床医生，掌握着丰富的人类样本，对于单细胞测序技术无疑是锦上添花。但许多临床工作者担心没有科研思路，不知道该如何进行实验。小编今天就用一篇文章来梳理单细胞测序思路，以供参考。
下面这篇文章是北医三院乔杰院士在2018年10月所发的人类睾丸单细胞测序工作。题目是“Single-Cell RNA SequencingAnalysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis”。
首先作者得到成人睾丸样本，保留了2,854个细胞用于随后的scRNA-seq分析。所有细胞利用tSNE可视化，展示了所有睾丸细胞类型并进行聚类。共分出连续的14个细胞群和独立的3个细胞群。接下来是精子发生时期所表达的不同表面Marker，用来展示不同位置的细胞群所处的精子发生时期，并定义细胞类型。
对于已经定义的14个生殖细胞的细胞群进行伪时序分析，可以得到细胞发育先后关系的顺序结果。因为不同的生殖细胞有着不同的增殖速率，所以作者将生殖细胞群中的细胞周期基因表达情况用热图展示，结果表明了在SSC中细胞增殖状态相对不活跃，在分化型精原细胞中，G1 / S和G2 / M期基因都是活跃的，之后逐渐退出细胞周期形成精子。与此相比睾丸体细胞几乎静止并且显示较低的增殖活性。同时作者还分析出不同时期细胞中特异性基因表达模式，随后使用免疫荧光对其进行了生物学验证。
接着作者利用之前分析的tSNE数据细化出3种精原细胞的亚群，先对这3种亚群进行差异基因的热图可视化，对这些差异基因进行GO分析。得到了不同差异基因所参与的生物学功能，如分析出簇1基因主要参与“细胞生物合成过程的负调节”等。之后将在3群中富集到的已知的Marker利用免疫荧光来对睾丸染色，验证所分析的细胞亚群是真正的新的亚群。
之后作者对精母细胞，精子细胞，睾丸体细胞也做了相似的数据分析以及生物学验证。
要想将文章发表于高水平杂志，那么光靠单细胞测序是不够的。如果能将文章上升到具有临床意义的高度，那就最好了。所以作者将临床中NOA患者的睾丸做HE染色鉴定，表明不可育，随后进行单细胞测序，并对其体细胞进行验证。分析了正常睾丸体细胞相比的差异表达基因并作出火山图将其可视化。对差异基因进行GO分析，可以得到NOA患者表达上调的差异基因所参与的生物学功能。
在实验的最后，作者利用MGI数据库和本次单细胞分析数据，对比了人与小鼠之间的基因，并表明精子发生相关事件在人和小鼠之间是保守的。同时利用OMIM数据库筛选出了51个男性不育和NOA相关基因，这些基因之前在人类中被鉴定出来。这些疾病相关基因中有49个是人鼠同源差异基因。这些结果表明在小鼠中使用基因消融来研究人类男性不育。
所以可以看出单细胞测序文章的最基本方法就是tSNE聚类，伪时序分析，差异基因分析，GO富集，最后用免疫荧光做验证。
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