骨关节炎(OA)是全世界最常见的骨科关节疾病之一，病理定义为局部炎症和软骨变性以及严重的负重区损伤和关节软骨退化。虽然一些药物可以消除炎症和减轻疼痛，但很少有药物针对OA的病理发展过程进行有效地防治。最近来自浙江大学的章淑芳教授和欧阳宏伟教授团队设计了一种可以局部缓释维替泊芬的壳聚糖微球系统，来抑制病损部位YAP的表达，从而起到缓解骨关节炎的作用，为骨关节炎的预防与治疗指明了一条新思路。首先，研究者收集了正常人膝关节软骨组织和OA患者膝关节软骨组织，并对其杨氏模量进行了测定，发现OA患者的软骨杨氏模量大约是正常软骨组织的6倍，并且在同一OA患者中病损较严重区域的杨氏模量相比于病损较轻部位更大。研究者们进一步检测了正常软骨和OA患者软骨中的YAP表达及其入核情况，结果表明OA患者软骨中软骨细胞的YAP表达增高，且有明显的入核现象，并且OA患者软骨组织中二型胶原（COL II）表达明显降低，结缔组织生长因子（CTGF）的表达明显上升。由此表明OA患者的软骨细胞外基质刚度升高，软骨出现变性，并且力学感受器YAP被激活（Fig. 1）。Fig. 1 Human cartilage ECM stiffening and YAP activation in clinical OA samples. 研究者接着探究了细胞外基质刚度对软骨细胞的影响。首先制备了不同投料比的即具有不同刚度的PDMS，在其表面培养软骨细胞后发现，相比于培养皿组，软骨细胞的COL II以及SOX9的表达在10：1 PDMS组表面升高明显，软骨细胞中的YAP定位多在细胞质之中，而培养皿表面生长的软骨细胞中YAP的定位则集中在细胞核中。另外，10:1 PDMS组中的YAP下游的CTGF表达会明显弱于培养皿组，这些结果表明10:1 PDMS的刚度可以使YAP大量定位于细胞质中而可以维持软骨细胞的表型（Fig. 2）。Fig. 2 10:1 PDMS substrate maintains the chondrocyte phenotype by YAP inactivation.然后，为了证明YAP确实在OA病理发展过程中被激活，研究者比较了YAP在正常小鼠与OA小鼠体内定位的变化。通过免疫组化发现，YAP在OA软骨的软骨细胞核中表达明显升高，而在正常软骨中YAP则主要分布在软骨细胞的细胞质中，并且YAP在OA软骨中磷酸化的比例明显低于正常软骨。定量分析也表明4周时正常小鼠中核内YAP的表达量为22.45%而OA小鼠的核内YAP表达量为55.43%；8周的结果也类似，正常小鼠中核内YAP的表达量为16.95%，而OA小鼠的核内YAP表达量为50.36%。这些结果证明，在OA的发展过程中，力学感受器YAP的核定位逐渐增加（Fig. 3）。
Fig. 3 Aberrant activation of chondrocyte YAP in OA progression. 随后研究者为了研究YAP在OA过程中的作用，培养了Col2-CreERT2和 Yap1fl/fl诱导的条件敲除（cKO）小鼠。实验结果表明YAP敲除小鼠中的COL II的表达明显高于同窝出生的对照组小鼠。番红精-O染色也表明YAP敲除小鼠的软骨丢失量明显低于对照组小鼠。OARSI评分也提示YAP敲除小鼠的OA严重程度较低。这些结果证明YAP在体内的缺失可以减少软骨的退行性变，表明了YAP可以通过调节软骨细胞的合成代谢从而影响OA的发展（Fi. 4）。Fig. 4 Rescued OA development in Col2-CreERT2; Yap1fl/fl mice after OA surgery.
既然YAP被证实在OA发展过程中被激活，那么通过小分子抑制YAP的表达能否起到抑制OA发展的效果呢？为了探索这个问题，研究者使用YAP抑制剂维替泊芬来处理细胞。结果表明使用5 μM的维替泊芬处理软骨细胞后，细胞中的YAP在细胞质内广泛分布，并且软骨细胞中的CTGF表达明显降低，COL II的表达明显升高。在人软骨外植体培养研究中，也可以明显观察到维替泊芬组OA的发展明显被抑制。这些结果表明维替泊芬作为YAP选择抑制剂可以较好的抑制OA的发展，是治疗OA的一种潜在药物（Fig. 5）。Fig. 5 YAP inhibition maintains chondrocyte phenotype and cartilage integrity via controlled YAP cytoplasmic retention.接着研究者为了更好地缓释维替泊芬，提高它的治疗效果，设计了一种壳聚糖微球缓释体系。通过测试其缓释性能发现，壳聚糖微球释放维替泊芬的特征是在第一天快速释放，随后5天缓慢释放，表明其缓释效果良好。然后研究者们使用这种缓释体系处理OA软骨细胞，发现相比于对照组，用微球维替泊芬缓释系统处理的OA软骨细胞中YAP的核表达明显降低，CTGF的表达也明显降低。由此表明壳聚糖微球缓释维替泊芬可显著降低软骨细胞中YAP的核表达从而对OA产生抑制作用（Fig. 6）。
Fig. 6 Sustained-release of Verteporfin downregulated chondrocyte YAP activity in vivo.最后，研究者使用这种壳聚糖微球维替泊芬缓释体系进行了体内实验，结果表明其可以明显抑制OA患者的软骨丢失，软骨组织损伤更轻。免疫荧光结果表明，相比于对照组，处理组COL II表达升高，而MMP-13的表达明显降低，由此表明局部缓释维替泊芬可以通过抑制YAP的表达，起到维持细胞外基质的硬度，从而在OA发展中起到维持软骨内稳态的作用(Fig. 7)。Fig. 7 Local administration of CM-Verteporfin rescued the cartilage degeneration during experimental OA development.综上所述，YAP是细胞外基质硬度改变的一个力学信号中介，并且也是OA治疗的一个靶点，设计的壳聚糖微球维替泊芬缓释系统可以通过抑制YAP的表达起到良好的抗OA作用，为以后OA治疗的发展提出了一条新思路。本研究由浙江大学章淑芳教授与欧阳宏伟教授团队完成，并于2019年12月26日在线发表于Biomaterials。论文信息： Xianzhu Zhang, Dandan Cai, Feifei Zhou, Jie Yu, Xinyu Wu, Dongsheng Yu, Yiwei Zou, Yi Hong, Chunhui Yuan, Yishan Chen, Zongyou Pan, Varitsara Bunpetch, Heng Sun, Chengrui An, Toh Yi-Chin, Hongwei Ouyang∗, Shufang Zhang∗. Targeting downstream subcellular YAP activity as a function of matrix stiffness with Verteporfin-encapsulated chitosan microsphere attenuates osteoarthritis. Biomaterials 2019, doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119724.
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