破骨细胞、PGE2、Netrin-1与腰痛

下腰痛是一种常见的健康问题。在全世界范围内，约有80-85%人群患有不同程度的腰痛，严重影响生活质量，并耗费大量医疗资源。90%的下腰痛为非特异性下腰痛，没有明显的病理解剖原因。椎间盘、小关节等腰椎结构可能是非特异性腰痛的来源，但临床资料显示，椎间盘退变常见于无症状的患者，这表明椎间盘退变对一些患者并不引起疼痛。因此，确定下腰痛的病因和相关机制对于有效治疗下腰痛至关重要。近期，约翰霍普金斯大学医学院曹旭教授团队和中南大学湘雅医院胡建中教授团队共同研究发现在终板退变硬化过程中，破骨细胞诱导感觉神经长入终板中，是导致腰痛发生的重要原因。

研究人员首先通过小鼠腰椎不稳（Lumbar Spine Instability，LSI）模型探究椎间盘退变与腰痛的关联及具体机制。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色显示LSI术后2周，终板内TRAP⁺破骨细胞数量显著增加，并一直维持在较高水平直到LSI术后8周。由于破骨细胞性骨吸收，在硬化终板中产生了大的骨髓腔。而在假手术组，小鼠的软骨终板保持完整。免疫荧光染色显示，LSI术后2周终板内降钙素基因相关肽CGRP⁺（疼痛神经纤维标志物）神经纤维开始显著增多，并持续至8周，而假手术组终板内未检测到CGRP⁺神经纤维。然而，在LSI和假手术小鼠中都没有检测到植物凝集素IB4⁺（非肽型疼痛神经纤维标志物) 神经纤维，表明CGRP⁺神经纤维是终板中主要的痛觉C类神经纤维（Figure 1）。研究人员在椎间盘自然老化过程中也发现上述现象（Figure 2）。

Figure 1. Sensory innervation in endplates correlates with increase of osteoclasts in LSI model.

Figure 2. Sensory innervation in endplates correlates with increase of osteoclasts during aging.

为阐明终板硬化介导疼痛行为的信号机制，研究人员通过RT-qPCR检测了在LSI和假手术小鼠终板中炎性细胞因子的表达。结果发现LSI术后4周，终板中前列腺素E合成酶(PGES)、环氧合酶-2(COX-2)、白细胞介素(IL)-1β、IL-17、IL-2和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平明显高于假手术组。PGES、COX-2和IL-1β可以促进终板中前列腺素E2（PGE2）的合成，这一点通过免疫染色和ELISA得到了证实。终板中PGE2的量在LSI术后4周达到高峰，在8周和12周亦保持较高水平。为检测终板中PGE2的来源，研究人员进行了COX-2与F4/80、COX-2与骨钙素(OCN)、COX-2与TRAP的联合免疫组化染色。结果表明，COX-2与F4/80⁺(成熟小鼠巨噬细胞标志物)细胞、一些OCN⁺（骨细胞标志物）细胞和少数TRAP⁺破骨细胞共定位。这些数据表明，终板中积累的PGE2来自不同类型的细胞。免疫组织化学染色显示PEG2受体4（EP4）在新长入LSI小鼠终板的CGRP⁺神经末梢有表达(Figure 3)，提示PGE2/EP4参与了脊柱疼痛超敏反应。之后，研究人员进一步探讨了PGE2/EP4在痛觉传导中的作用机制。应用EP4^flox/flox小鼠和Avil^Cre小鼠杂交，产生Avil^Cre；EP4^flox/flox小鼠（命名为EP4^−/−小鼠，该小鼠的感觉神经中EP4被特异性敲除）。结果发现PGE2激活感觉神经元中的EP4，通过cAMP信号通路诱导钠离子内流，这可能与痛觉传导有关（Figure 4）。

Figure 3. PGE2/EP4 contributes to the spinal pain hypersensitivity.

Figure 4. PGE2 stimulates PKA/CREB signaling through EP4 to induce sodium influx.

随后，研究人员探究破骨细胞是否诱导CGRP⁺感觉神经长入终板，应用Rankl^flox/flox小鼠与Dmp1^Cre小鼠杂交，产生Dmp1^Cre；Rankl^flox/flox小鼠(命名为Rankl^−/−小鼠，该小鼠的DMP1⁺骨细胞中Rankl被特异性敲除)。骨细胞Rankl缺乏导致破骨细胞数量减少和严重的骨硬化表型。μCT分析显示Rankl^−/−小鼠的骨小梁BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著增加，Tb.Sp显著降低，表明Rankl^−/−小鼠的椎体为骨硬化性椎体。但是LSI术后的Rankl^−/−小鼠终板硬化明显延迟，μCT分析也显示其终板的孔隙率和骨小梁间隔减少。Rankl^−/−小鼠的终板迟发性硬化在Safranin O染色中得到进一步验证。在LSI术后4周和8周，Rankl^−/−小鼠终板中TRAP⁺破骨细胞的数量明显减少。免疫染色显示Rankl^−/−小鼠中CGRP⁺感觉神经明显减少。为了检验破骨细胞诱导的终板感觉神经长入是否与脊柱疼痛相关，研究人员进行了疼痛行为测试，发现Rankl^−/−小鼠的压力耐受阈值明显高于Rankl^flox/flox小鼠。自发活动分析表明，LSI术后的Rankl^−/−小鼠每24小时的行走距离、最大速度、平均速度和活动时间都明显高于Rankl^flox/flox小鼠（Figure 5）。这些结果表明，感觉神经长入椎体终板所致的疼痛与破骨细胞活动有关。

Figure 5. Decreased osteoclasts activity diminishes sensory innervation and attenuates pain.

此外，研究人员发现硬化的终板中TRAP⁺破骨细胞能够分泌Netrin-1（一种神经导向因子），并且Netrin-1水平随着LSI造模时间的延长而升高。为探明破骨细胞来源的Netrin-1是否诱导了感觉神经的长入，研究人员应用Trap^Cre小鼠与Netrin-1^flox/flox小鼠杂交，产生Trap^Cre；Netrin-1^flox/fox小鼠（命名为Netrin-1^−/−小鼠，该小鼠的TRAP⁺细胞中Netrin-1被特异性敲除）。番红固绿染色表明，与Netrin-1^flox/flox小鼠相比，LSI所致Netrin-1^−/−小鼠的终板硬化程度没有明显差异。并且，TRAP染色显示两者中的破骨细胞数量相似，表明Netrin-1不参与调控终板硬化过程。有趣的是，研究人员发现，与假手术组相比，尽管Netrin-1^−/−小鼠在LSI术后，终板中TRAP⁺的破骨细胞增加，但是CGRP⁺感觉神经并未增加。而且Netrin-1^−/−小鼠的疼痛行为测试中，压力耐受阈值明显高于Netrin-1^flox/flox小鼠（Figure 6）。这表明破骨细胞来源的Netrin-1介导了脊椎终板感觉神经长入，从而诱发疼痛。

Figure 6. Knockout of netrin-1 abrogates sensory innervation and spinal pain.

该研究由约翰霍普金斯大学医学院曹旭教授团队和中南大学湘雅医院胡建中教授团队共同完成，并于2019年12月发表于Nature communications。

论文信息：

Shuangfei Ni, Zemin Ling, Xiao Wang, Yong Cao, Tianding Wu, Ruoxian Deng, Janet L. Crane, Richard Skolask, Shadpour Demehril, Gehua Zhen, Amit Jain, Panfeng Wu, Dayu Pan, Bo Hu, Xiao Lyu, Yusheng Li, Hao Chen, Huabin Qi, Yun Guan, Xinzhong Dong, Mei Wan, Xuenong Zou, Hongbin Lu, Jianzhong Hu*, Xu Cao*. Sensory innervation in porous endplates by Netrin-1 from osteoclasts mediates PGE2-induced spinal hypersensitivity in mice. Nat Commun 2019, 10(1): 5643.

供稿：王欢

审校：过倩萍

编辑：魏强