多糖-肽冷冻凝胶用于多重耐药细菌感染伤口的愈合和止血

在临床上伤口敷料作为一种重要的材料可以同时治疗细菌感染和各种出血并发症。然而，多重耐药(MDR)细菌感染对临床伤口护理提出了一个新的挑战，因为针对这些细菌的有效抗菌药物很少。为了满足临床需要，北京航空航天大学的樊瑜波、周瑾教授团队与中国医学科学院阜外医院的冯新星医生团队研制了具有良好抗菌、止血性能的多糖-肽低温凝胶。这种凝胶以乙二醇壳聚糖(GC)和ε-poly赖氨酸(EPL)为主要成分，与市售的止血敷料相比可以显著地降低失血量。凝胶中的EPL显著增强了抗菌活性并防止细菌感染皮肤伤口，低温凝胶处理的伤口显示出更高的愈合效率。研究证实了GC-EPL多肽类低温凝胶是一种有良好前景的多功能创面敷料，可用于止血和细菌感染的伤口愈合。

除化学成分外，敷料的微观结构对敷料的生物活性也有重要影响。GC-EPL低温凝胶通过EPL-A和GC-MA在低温下交联制备，其具有内在的相互连接的大孔结构，其特有的结构使其能够在受压后将游离水挤出，并通过吸水迅速恢复到原来的形状(图1)。因此，在止血和抗菌测试中低温凝胶可以迅速吸收血液和含有病原体的液体。

Figure 1. Fabrication of the GC-EPL cryogel and its compression behavior. a) The GC-EPL cryogel is fabricated by cryogelation of EPL-A and GC-MA at -20 °C. Under compression, the free water in the cryogel is squeezed out and the water is refilled after the removal of the force. b) The photographs of GC-EPL cryogel in a compression cycle.

通过测定冷冻凝胶的溶胀比来评估其吸水能力。如图2a所示，GC低温凝胶的溶胀率约为4000%(干制冷冻凝胶吸收的水分)。加入EPL后，溶胀率略有增加，这可能与EPL的亲水性有关。用扫描电镜研究了低温凝胶的微观结构(图2b)，发现凝胶具有大量的多孔结构，多孔结构也使低温凝胶具有较高的压力应变回弹性。压缩试验表明，无论EPL是否存在，低温凝胶都能承受高达90%的压缩应变(图2c)，而EPL的加入略微降低了低温凝胶的机械强度。因为伤口敷料或止血剂需要可塑性以适应周围组织，因此良好的压缩弹性在这些应用中是一个优势。

Figure 2. Swelling ratio, microstructure and mechanical property of the cryogels. a) Swelling ratio of cryogels with different amount of EPL. b) Scanning electronic microscopic observation of the cryogels. All the cryogels display an interconnected macroporous structure. c) The compressive stress–strain  curve of the cryogels. All the cryogels can withstand compressive strain as high as 0.9 and the incorporation of EPL slightly reduces the mechanical strength. All data are represented as means ± s.d.

研究者通过全血凝血实验来评价低温凝胶的止血效果(图3a)。将全血加入脱水的冷冻凝胶中一段时间(60秒)后，没有血液从材料中渗出。血红蛋白的吸附值越高代表材料的凝血效果越显著，研究者采用美国军方的纱布与明胶海绵作为对照组进行比较，结果显示低温凝胶的凝血率更高，并且加入了EPL的低温凝胶凝血率得到进一步提升。采用大鼠肝脏出血模型进一步评价低温凝胶在体内的止血作用(图3b)，可以看到低温凝胶处理组的出血量明显低于未处理组，特别是GC-EPL-2（2% GC-MA and 0.25% EPL-A）冷冻凝胶与未处理组相比可减少90%以上的失血(图3c)。

Figure 3. The hemostatic performance of different materials invitro and in vivo. a) The whole blood clotting index (BCI) of different materials. The decreased BCI for the GC and GC-EPL-2 cryogels indicate the high clotting rate. GC-EPL cryogels demonstrate higher clotting rate than GC cryogels, indicating that the EPL can enhance the clotting rate. b) The ratliver injury model is employed to test the hemostatic performance. c) GC-EPL cryogels reduce 90% of the blood loss compared to the nontreated control. The in vivo hemostatic property of GC and GC-EPL cryogels outperform the commercial hemostatic agent. All data are represented as means ± s.d., n ≥ 3, *P < 0.05, **P < 0.01.

因为壳聚糖的抗菌作用有限，研究者们利用EPL的掺入可以增强低温凝胶的抗菌性能(图4)。研究者采用革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和革兰氏阴性大肠杆菌进行体外抗菌试验，无EPL的冷冻凝胶对金黄色葡萄球菌的杀灭效率为77.84%，对大肠杆菌的杀灭效率为68.59%。而含有0.25% w/v EPL的凝胶的杀菌效率可以达到99%以上。这一实验证明含有EPL的凝胶具有更好的杀菌效果，并且随着EPL浓度的增加杀菌效果也进一步提高。

Figure 4. The bacteria killing efficiency of different cryogels against a) MRSA and b) E. coli. It is noted that GC-EPL-2 and GC-EPL-4 achieved a killing efficiency higher than 99%. All data are represented as means ± s.d., n ≥ 3.

研究者采用全层小鼠皮肤创面模型评价GC-EPL低温凝胶在体内对抗MRSA感染的效果。图5采用GC-EPL-2型低温凝胶进行体内研究，证明其抑菌率高(>99%)，具有良好的生物相容性和良好的机械性能。实验证明经低温凝胶处理的MRSA感染组与未感染组类似无感染迹象。取创面周围组织进行体外培养，然后进行组织学观察，创面组织的组织学图像证实感染组具有较多的炎性细胞，而GC-EPL冷冻凝胶组和未感染组炎症细胞较少。结果还表明，GC低温凝胶没有明显的抗感染作用，这说明EPL对于低温凝胶在体内的抗感染作用至关重要。

Figure 5. The in vivo antibacterial efficiency of the cryogels in amouse skin wound infection model. a) Photographs of the skin wounds at day 3. Skin wounds in the infected control group and GC cryogel group display typical MRSA infection, while the skin wound in the GC-EPL-2 cryogel treated group appears to be similar with that in the uninfected control group. b) Optical images of Masson trichrome stained tissue sections at day 3. The infected control group and GC cryogel group demonstrate a dense inflammatory cell infiltrate, while the GC-EPL cryogel group demonstrates much less inflammatory cell infiltrate.

研究者对伤口闭合度进行12天的监测，分别在第3天、第7天和第12天测量闭合率(图6a)。感染创面在各个时间点的愈合都非常有限，说明细菌感染严重阻碍了创面的正常愈合过程。相比之下，经GC-EPL冷冻凝胶处理的实验组在第12天创面闭合率超过85%，与未感染对照组无统计学差异(图6b)。GC低温凝胶组创面闭合度明显低于GC-EPL低温凝胶组，这进一步证实了GC低温凝胶只有有限的抗感染效果。组织学图像进一步验证了观察结果:与感染组和对照组相比，经GC-EPL冷冻凝胶处理的伤口具有更高的表皮覆盖度和成熟的组织结构。这些结果证实了GC-EPL冷冻凝胶可以预防MRSA感染并促进伤口愈合过程。

Figure 6. Infected wound healing performance of the cryogels. a) Photographs of wounds at D3, D7, and D12 for infected control, GC, GC-EPL-2, and uninfected control group. b) Wound closure for infected control, GC, GC-EPL-2 and uninfected control group. c) Optical images of Masson trichrome stained tissue sections at D12. Nearly complete epithelium layer coverage and granular tissue formation are presented in GC-EPL cryogel group. The black arrows indicate the edges of the unclosed wounds. All data are represented as means ± s.d., n ≥ 3, *P < 0.05.

本研究由来自北京航空航天大学的樊瑜波、周瑾教授团队与中国医学科学院阜外医院的冯新星医生团队完成，并于2019年12月23日在线发表于Advanced Healthcare Materials。

论文信息：

Sen Hou,Yuanyuan Liu, Fang Feng, Jin Zhou,* Xinxing Feng,* and Yubo Fan*. Polysaccharide-Peptide Cryogels for Multidrug-Resistant-Bacteria Infected Wound Healing and Hemostasis. Adv Healthc Mater 2019, DOI：10.1002/adhm.201901041.

供稿：丁路光

审校：陈嵩

编辑：韩峰