BMP-2修饰多孔复合支架促进骨愈合

三维多孔支架可以很好地替代自体移植和同种异体移植用来修复，它们可以用于种子细胞的装载，而这些细胞可以增殖和分化为骨细胞从而促进新骨再生。然而，聚合物支架由于缺乏生物活性，因此在骨缺损方面的应用受到了限制。改善多孔高分子支架生物活性的有效策略之一是引入具有生物活性的无机填料。来自四川大学高分子科学与工程学院的徐家壮教授团队和华西口腔医院的李继华教授团队设计了一种多孔复合支架来提高支架的生物活性并将其用于骨缺损的治疗。研究者将纳米羟基磷灰石（nHA）、生物活性玻璃（BG）和聚己内酯（PCL）共混制备成多孔复合支架，然后使用聚多巴胺（pDA）来进行表面修饰并负载骨形态发生蛋白-2（BMP-2），提高PCL支架的生物活性和成骨性能，最终实现骨的快速愈合。

研究者将制备的PCL/nHA/BG、PCL/nHA/BG/pDA、PCL/nHA/BG/BMP-2和PCL/nHA/BG/pDA/BMP-2复合支架分别用PHB、PHB-pDA、PHB-BMP-2和PHB-pDA-BMP-2来表示。研究者首先进行了复合支架的结构表征，扫描电镜图像显示了复合支架的横截面形态（图1A）。在较低倍率（200 X）下，所有支架均呈均匀的、相互连通的开孔三维多孔结构。在高倍率下（80000 X），纯PCL支架表面均匀光滑，而PHB支架可以清楚地看到棒状的纳米羟基磷灰石晶体均匀分布在孔壁表面。PHB-pDA支架呈现出与PHB支架相似的粗糙孔表面。经过接枝BMP-2之后，孔壁表面出现大量蛋白质颗粒，进一步增加了表面粗糙度。图1B采用X射线光电子能谱对制备的支架进行了表面化学成分分析。PCL和PHB支架有两个峰，分别对应C1s和O1s。pDA改性后，由于pDA中氮组分的存在，PHB-pDA支架的能谱出现N1s峰。BMP-2的进一步修饰提高了N1s峰的强度，表明BMP-2成功沉积在PHB-pDA支架上。图1C对多孔支架的化学成分进行了定量分析，在PCL和PHB支架上没有检测到元素氮，而在pDA涂层的PHB支架上检测到3.74%的元素氮。

Figure 1. (A) SEM images of porousPCL-based scaffolds at different magnifications (200 X and 80000 X). Thecorresponding optical photos of porous scaffolds are shown in insets. Whitearrows indicate BMP-2 protein granules on the surface of pore wall. (B) XPSanalysis and (C) quantificational atomic chemical composition of porousPCL-based scaffolds.

研究者随后进行了多孔复合支架中BMP-2释放的定量研究。在制备的PHB-pDA-BMP-2支架中，研究人员观察到了长达30天的持续BMP-2释放。第一天，只有4.86±3.2% 的骨形态发生蛋白-2从制备的支架中释放出来。相比之下，PHB-BMP-2支架释放了约54.5±9.6% 的BMP-2，并且在第16天达到完全释放。实验结果表明BMP-2通过pDA涂层稳定地保留在多孔支架上（图2）。

Figure 2. Profiles of BMP-2 released fromPHB-BMP-2 and PHB-pDA-BMP-2 scaffolds. The data are presented as mean ± SD (n =3 per group).

研究者还进行了BMSCs细胞在支架上的细胞增殖实验。图3A展示了样本表面骨髓间充质干细胞的激光扫描共聚焦显微镜图像。接种6h后，BMSCs在PHB支架上的铺展形态和贴壁率均高于纯PCL支架，说明生物活性填料的引入促进了PCL支架的细胞黏附。细胞计数分析显示，PHB、PHB-pDA和PHB-pDA-BMP-2支架的细胞密度没有显著差异（图3B）。将细胞在多孔支架上的培养时间延长，虽然所有支架均表现出良好的细胞相容性，但单纯的PCL支架在孵育1天和7天后细胞数最少。与细胞粘附结果相似，改性支架的光密度值明显高于裸PCL支架，在PHB-pDA-BMP-2支架上达到最大值。这些结果表明所制备的多孔复合支架促进了骨髓间充质干细胞的增殖（图3C）。

Figure 3. (A) Fluorescence images of BMSCsafter 6 h of incubation on porous scaffolds (red represents F-actin, while blueindicates nuclei). (B) Quantitative cell density at 6 h after seeding. (C) Cellproliferation after 1 and 7 days of culture. ∗p< 0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p< 0.001; NS: not significant. The data are presented as mean ± SD (n = 3 pergroup).

最后研究人员利用多孔复合支架进行体内骨再生实验。将多孔复合支架植入兔的颅骨缺损中，检测其体内成骨能力。植入6周后，PHB-pDA-BMP-2支架在颅骨缺损区域显示出明显的新骨形成。相反，在Micro-CT三维重建图像中，PCL支架和未经处理的对照组几乎没有矿化基质（图4A）。此外，PHB和PHB-pDA支架也有利于颅骨缺损区域新骨的形成。图4B描述了缺损区的定量骨体积参数。6周时，PHB-pDA支架的BV/TV（43.6%±2.9%）明显高于PHB支架（17.1%±1.6%）。12周后，单纯缺损组（18.3%±1.4%）和裸支架组（6.3%±0.4%）出现有限的骨再生，但PHB-pDA-BMP-2支架的植入使颅骨缺损的骨再生接近完全（83.3%±8.2%）。关于组织学分析的再生骨面积比，变化趋势与定性骨体积分数一致，如图4C所示。这些结果表明，PHB-pDA-BMP-2支架在短时间内能显著增加颅骨缺损的矿化，缺损骨组织几乎完全愈合。

Figure 4.(A) Micro-CT images of new bone formation after implantation for 6 and 12weeks. (B) Quantification of % BV/TV in the defect. (C) Quantitative analysis ofregenerated bone area ratio. ∗p <0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p< 0.001; NS: not significant. The data are presented as mean ± SD (n = 5 pergroup).

本实验通过将生物活性填料和生物分子同时整合到聚合物基质中，制备出具有高度骨诱导性的复合支架。pDA涂层的存在不仅明显改善了PHB支架的表面润湿性和亲和力，而且可以实现BMP-2的有效接枝。释放曲线显示，BMP-2可从PHB-pDA-BMP-2支架中持续释放30天以上。这种新型支架能够在植入兔颅骨缺损后实现良好骨愈合。因此，这种构建复合支架的策略为促进骨再生提供了一条可行的途径。

本研究由四川大学高分子科学与工程学院的徐家壮教授团队和华西口腔医院的李继华教授团队共同完成，并于2019年11月发表于ACS Appl Bio Mater。

论文信息：Xiang Li, Hua-Mo Yin, En Luo, Songsong Zhu, Peng Wang, Zhen Zhang, Gui-Qing Liao, Jia-Zhuang Xu*, Zhong-Ming Li, and Ji-Hua Li*. Accelerating Bone Healing by Decorating BMP-2 on Porous Composite Scaffolds. ACS Appl Bio Mater 2019，2：5717−5726.

供稿：陈起新

审校：陈嵩

编辑：韩峰