骨缺损的修复在临床上是一个紧迫的挑战。一旦发生骨损伤，生物医用材料就可用来加速骨缺损的愈合。水凝胶含水量高并且具有多孔结构，可以完美地模拟人体组织的细胞外基质环境，应用于骨缺损的修复前景广阔。然而，力学强度不足限制了水凝胶支架材料在人体中的应用。壳聚糖和聚乙烯醇（PVA）复合可用于制造具有优异机械性能和生物相容性的薄膜或凝胶。但传统的壳聚糖-PVA凝胶主要基于化学交联，并且有毒残留物和较差的机械性能限制了它们在组织工程中的应用。近期中国海洋大学海洋生命学院陈西广教授课题组和青岛大学医学院邢士超课题组共同设计了一种基于物理交联的壳聚糖-PVA双网络水凝胶，其具有高的强度和良好的生物相容性，在骨组织工程领域具有潜在的应用前景。
研究者以壳聚糖作为双网络凝胶的脆性第一网络，PVA作为韧性第二网络（Scheme 1a）。壳聚糖碱性溶液（5 wt%）与PVA溶液（5 wt%）混合并升温到50℃后，壳聚糖链之间氢键的动态平衡被破坏，形成壳聚糖第一网络。然后通过冻结-融解过程引入PVA第二网络。低温下PVA分子链会形成结晶区，并与壳聚糖链相互作用形成稳定的氢键，得到壳聚糖-PVA水凝胶（CPH）。随后将CPH在CaCl2溶液和K2HPO4溶液中交替浸泡诱导羟基磷灰石（HAp）矿化层的形成（Scheme 1b），得到表面矿化的壳聚糖-PVA水凝胶（CPHH）。在反复浸泡后，CPH变成不透明的白色（Scheme 1c and d）。SEM显示，CPH表面覆盖了500 μm的HAp矿化层（Scheme 1e and f）。同时，CPH和CPHH的荧光观察也证实了CPH表面HAp矿化层的形成（Scheme 1g and h）。Scheme 1. The preparation of (a) CPH and (b) CPHH. (c and d) The morphology of CPH and CPHH. (e and f) Microscopic observation of CPH and CPHH. (g and h) Fluorescence observation of CPH and CPHH.EDXS能谱分析显示了CPHH矿化区和非矿化区之间的元素组成，矿化的CPHH表现出高强度的C，O，P和Ca峰，其钙磷比（Ca/P=1.52）非常接近HAp（Ca/P =1.67）。用TGA测定了水凝胶的热稳定性，当温度升高到800℃时，CPHH中仍有38%的残留物，显著高于CHH中残留物百分比，进一步证实了CPHH中矿化层的存在。用XRD对CPHH表面层的物相进行了验证，发现CPHH表层的HAp结晶度比纯HAp低，表明HAP成功地引入了CPHH的表面层（Fig. 1）。
Fig. 1. Characterization of CPH and CPHH. (a) The EDXS spectra and elemental composition of CPH; (b) CPHH mineralized area; (c) TGA spectra of CPH and CPHH; (d) XRD spectra of CPH, CPHH and HAp.
研究者进行了CPH和CPHH的溶胀实验。结果表明在37℃，pH=7.4的PBS中浸泡24小时后，CPH和CPHH都能保持稳定的形状和重量，并且CPH的重量和直径的变化 （29%和9%）比CPHH（1%和4%） 更明显。说明CPHH在PBS中具有更高的稳定性，这一特性有利于其在骨组织修复中的应用。用扫描电镜观察水凝胶的内部结构，所有的水凝胶都具有多孔结构，并且很容易在CPHH的表面上找到矿化区（Fig. 2）。Fig. 2. Swelling characterization of CPH and CPHH. (a) Weight and diameter change rate of CPH (CPH-D and W) and CPHH (CPH-D and W) after swelling for 24 h in PBS (pH 7.4) at 37 °C; (b) SEM images of CPH and CPHH; (c) Pore size of CPH and CPHH; (Scale bar: 1 cm) (d) Equilibrium swelling ratio of hydrogels after swelling for 24 h in PBS (pH 7.4) at 37℃ .研究者对水凝胶的力学强度也进行了研究，Fig. 3a和Fig.3d显示了CPH和CPHH的压缩应力-应变曲线，水凝胶在压缩和拉伸中没有发生断裂（Fig.3c and e）。CPH的压缩应力达到58.7kPa，拉伸强度达到243kPa。CPHH的压缩应力达到66.9kPa，拉伸强度达到281.3kPa。而且两种水凝胶都具有良好的抗疲劳性能，经过五次压缩和拉伸循环后，其形状和强度可以保持完整（Fig.3b, f, g）。Fig. 3. Mechanical characterizations of CPH and CPHH. (a) Compression stress strain curves of CPH and CPHH at strains from 0% to 60%; (b) Cyclic compression tests of CPHH at astrain of 60% under the deformation rate of 6 mm/min; (c) Photographs of compression and release process of CPHH; (d) Tension stress strain curves of CPH and CPHH at strains from 0% to fracture; (e) Photographs of tension and release process of CPHH; (f and g) Cyclic tensile tests of CPH and CPHH at astrain of 100% under the deformation rate of 6 mm/min.Fig. 4a显示了CPH和CPHH对牛血清蛋白（BSA）的吸附实验结果。水凝胶与BSA溶液接触后，蛋白质吸附量迅速增加，在8 h （CPH） 和16 h （CPHH） 达到最大值。但在吸附平衡状态下，它们均小于0.7 ug/mg。所有结果表明CPH和CPHH与血液接触是安全的。如Fig. 4b所示，两种水凝胶的溶血率 （200 mg/mL）均低于国际允许的5%水平，满足骨修复要求。Fig. 4c-f为水凝胶的细胞相容性实验结果。用CCK-8比色法评价水凝胶提取物对L929s和BMSCs的作用。结果表明CPH和CPHH对细胞增殖没有影响。钙黄绿素染色结果也表明L929s和BMSCs可以在水凝胶表面正常增殖。同时，CPHH表现出比对照和CPH更好的促进细胞增殖的能力。Fig. 4. Biocompatibility of CPH and CPHH. (a) Total BSA absorption of CPH and CPHH in PBS (0.02 M, PH = 7.4) at 37°C; (b) Hemolysis rate of CPH and CPHH; (c and d) L929 cells and rBMSCs viability when contacting with CPH and CPHH; (e and f) Live staining of L929 cells and rBMSCs after contacting with CPH and CPHH for 3 days. Data indicate mean ± SD (n = 5). (Scale bar: 60 μm).水凝胶表面与细胞结合的能力是其在组织工程中应用的重要指标。结果显示，接种的大鼠BMSCs能在CPHH表面扩散、增殖和粘附，表面呈现均匀的平整结构，形态良好。相反，在CPH表面很难找到放射状结构。以上结果证实了具有HAp矿化层的CPHH在骨修复领域具有潜在的应用前景（Fig. 5）。Fig. 5. The morphology of BMSCs when contacting with CPH and CPHH for 3 days.研究者选择ALP染色来确定CPH和CPHH是否具有成骨诱导的功能。结果表明，培养10天后，CPHH上的ALP水平高于CPH和对照（Fig. 6d）。另外，用免疫组织化学方法检测成骨分化蛋白，包括OCN，ALP和COL I的表达水平。3天后，这些标记蛋白在CPHH组中的表达明显高于对照组和CPH（Fig. 6a–c）。这些结果表明，CPHH促进BMSCs的成骨分化，具有应用于骨再生的潜力。Fig. 6. Immunohistochemical analysis of osteogenic differentiation of Rat BMSCs grown in control, CPHH and CPH. The expression of osteogenic-associated (a) OCN, (b) OPN and (c) ALP after incubated for 3, 7, 14, and 21 d, respectively. (d) ALP staining after 10 days of osteogenic culture in control, CPH and CPHH. (*p < 0.05).研究者建立兔股骨外侧髁骨缺损模型，评价CPH和CPHH的骨修复效果。如Fig. 7a和Fig.7b所示，在股骨外侧髁上造成骨缺损，然后植入水凝胶，作为对照，在对侧膝关节内的骨缺损不植入任何材料。植入后1个月、2个月和3个月通过CT检测骨缺损部位新组织的出现（Fig. 7c）。2个月后对照组仍可观察到明显的骨缺损空洞。植入CPHH的缺损处有新骨形成，表明新骨可以在CPHH表面生长，水凝胶可以作为诱导新骨生长的支架。3个月后，CPH组和CPHH组未见明显缺损，新生骨与原骨融合。Fig. 7. (a) Illustration of gel implantation in the 5 mm in diameter and 8 mm in deep bone defect created inthe lateral of femoral condyle, and a 5.2 mm in diameter and 8 mm in length cylindrical shaped test samples were implanted into the bone defect. (b) CT images of bone defects model. (Front, Longitudinal section and Cross section) (c) CT images of gel implanted and non-implanted bone defects after 4, 8 and 12 weeks. (Scale bar: 1 cm).组织学染色结果进一步证实，与CPH和未处理对照相比，表面矿化的CPHH具有良好的骨修复效果（Fig. 8a and b）。植入后4周，CPHH处理的骨缺损内可见一层完整而疏松的新骨，新生骨与水凝胶的边界不明显。如Fig. 8c-e所示，CPHH组在1个月、2个月和3个月时的BMD、BV/TV和骨修复比率均显著高于CPH和对照组。这些结果表明，在CPH中引入HAp增强了水凝胶-骨界面结合能力和促进新骨再生的能力。Fig. 8. Tissue section analysis of hydrogel bone repair effect. (a) The images of hematoxylin-eosin (H＆E) staining and (b) Masson of the decalcificated bones slice, showing the newly mineralized bone tissue (NB) at 4 weeks and 12 weeks. (Scale bar = 100 um) (c) Bone mineral density (BMD), (d) the ratio of bone repair and (e) bone tissue volume / total tissue volume (BV/TV). (*p < 0.05, compared with control groups).为了进一步评估CPHH是否具有促新骨形成的作用，研究者通过免疫组织化学染色检测COL I和OCN。结果如图Fig. 9a-c所示。植入后，CPHH和CPH组的COL I和OCN表达水平高于对照组和CPH组，进一步证明CPHH的修复效果最好。Fig. 9. The immunofluorescence histochemical staining of decalcified bone slices showed a higher expression of osteogenesis related protein including COL I and OCN in the CPHH than CPH and control groups at 4 weeks and 12 weeks. (Scale bar = 100 um).综上所述，该研究构建的这种表面矿化的物理交联PVA/壳聚糖双网络水凝胶具有高强度、高孔隙率、生物降解性好和骨诱导能力强的特点，有应用于骨组织修复的潜力。
本研究由中国海洋大学海洋生命学院陈西广教授课题组和青岛大学医学院邢士超课题组共同完成，并于2019年8月11日在线发表于Carbohydrate Polymers。论文信息：Shichao Bi, Pengjun Wang, Shihao Hu, Shaoke Li, Jianhui Pang, Zhongzheng Zhou, Guohui Sun, Liang Huang, Xiaojie Cheng, Shichao Xing**, Xiguang Chen*. Construction of physical-crosslink chitosan/PVA double-network hydrogel with surface mineralization for bone repair. Carbohydrate Polymers 2019, 224：115176.
供稿：陈起新
审校：陈嵩
编辑：韩峰
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