流式实验中的坑，我都帮你踩过了-第二坑

病例介绍

CytoFlex 2L6C的仪器，客户反馈做小鼠脾脏细胞检测，预实验发现PE和PC5通道的补偿怎么也调节不好。当把PE,PC5通道单染管按顺序调节成“横平竖直”了，回头发现PE单染管的某些通道补偿又明显不对了。PE-CD19,Percp-cy5.5-CD45.

PE单染管（图一）：

Percp-cy5.5单染管（图二）：

回头再看PE单染管（图三）：

小贝问诊答疑

要来原始数据分析发现，制备的样本空白细胞管都有“阳性信号”，荧光通道组合会有对角线火箭峰细胞存在。如图四箭头部分。

PE-CD19单染管，明显多出来一群细胞，B细胞的特点明显不会有类似弱阳，强阳两群存在，而且看起来像强阳的那一群不像是目的细胞。（图五中绿颜色细胞）。

询问客户仪器质控及清洗情况了解到，已经好久没有做过质控，每次开机做实验会走清洗流程，但也好久没做过深度清洗，仪器平时做周期凋亡实验多。

空白管（图四）：

PE单染管（图五）

小贝处方

对角线火箭峰细胞，可能是样本制备过程中本身产生的死细胞，死细胞会有很强的自发荧光，会有一种表现就像很多荧光通道组合会有对角线细胞。建议改善样本制备的过程。

也可能是由于仪器管路不干净，因为经常会做有PI染料的实验，PI染料粘性大，不好清洗，清洗不够会使管路比较脏，可能是管路里的脏细胞又被带出来。当以绿颜色细胞为基准调成“横平竖直”时，某些通道就过补偿了。

解决方法：让客户好好清洗仪器，做质控，确保仪器状态ok情况下，再重复实验看看结果怎样。经后续反馈，问题解决。

思维发散区

为了获得好的数据结果我们肯定需要在前期样本制备环节多做功夫，但如果有些样本自发荧光特别强，我们可以在哪些方面做改进呢？

大家可以根据自己所学流式知识思考一下，欢迎大家填表问答，我们将送出“解压神器“，答案下期公布。

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文末福利 | 流式实验中的坑，我都帮你踩过了—第一坑

“为什么GFP强荧光的那群细胞群体，却是散射光图中SSC比较大的那群被P1门漏圈的细胞呢？”

答案：

从我们流式的角度思考这个问题的话，我们知道FSC代表前向散射光，主要反应细胞的大小，细胞越大，则FSC信号越强，而SSC代表侧向散射光，主要反应细胞的颗粒度，细胞内部越复杂，则SSC信号越强，上一期的案例中该老师的细胞转染了含GFP荧光的病毒，这些病毒颗粒被成功转染进细胞后，其实我们可以理解为细胞内部的颗粒度提高了，因此该细胞被检测时则SSC信号明显曾强，也就是原文中描述的点，当然大家可以有其他观点，本次解析仅供参考，不是标准答案，谢谢大家的关注！

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