荧光粉选择
荧光探针或荧光团(荧光染料或蛋白质)与二级抗体或链霉亲和素偶联,以使分析物可视化。每个荧光团都有自己的光谱特性,分子特有的激发光谱和发射光谱。Jackson荧光有助于多种技术同时检测多种分析物,包括流式细胞术、荧光显微镜(表观荧光、共焦、多光子和超分辨技术)、Western blotting和ELISA。
荧光探针的选择取决于许多实验变量,如下所述。还有一个Spectra Viewer Tool可帮助进行实验设计。
Jackson荧光粉选择技巧:
荧光团的选择取决于预期应用。样品的具体情况会影响选择,因为它们可能适应特定荧光团的使用,而制备可能会改变荧光团的行为方式。下表列出了一些与为特定技术选择荧光团相关的注意事项。
仪器性能
考虑激发能力(灯、激光器或LED决定激发波长)以及可用通道和滤波器的数量。还应考虑检测系统、数据收集持续时间和分析后分析。
需要灵敏度
任何荧光抗体结合物的检测水平取决于染料的亮度和光稳定性;抗体活性、特异性和交叉反应性;最佳染料抗体比(每摩尔抗体的染料摩尔数)。已对每种JIR染料结合物的这些参数进行了研究,以优化抗体检测水平并最小化背景。较大的藻胆蛋白具有较高的量子产率(非常明亮),但仅限于表面应用。通过选择较亮的荧光团,可以增强对表达差的分析物的检测。例如,Alexa Fluor®488比FITC更亮。
实验样品
考虑样本的自体荧光和重组荧光标记蛋白的可能表达。选择光谱不与内源性荧光重叠的荧光团。
要求分色程度
对于多种标记协议,染料面板的选择将受到上述仪器和样品细节的限制。要实现良好的分色,请选择光谱重叠最小的荧光团。
Jackson光谱查看器
荧光探针或荧光团(荧光染料或蛋白质)与二级抗体或链霉亲和素偶联,以使分析物可视化。每个荧光团都有自己的光谱特性,分子特有的激发光谱和发射光谱。使用光谱查看器构建染料面板,并比较染料的适用性。通常建议用于多重标记的四种染料是预先装载的,可以根据需要进行更改。
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