多重标记是通过免疫荧光或比色IHC/ICC检测多种抗原的顺序免疫标记过程。成功检测一种以上抗原需要合理的实验设计，考虑到每个实验步骤积累的大量变量。
在这里，Jackson详细介绍了如何建立多重标记实验，以及执行成功分析所需的一些注意事项。
图：小鼠GFAP（绿色）、NF（红色）、胶原蛋白IV（灰色）、波形蛋白（蓝色）z1。图片由加州大学圣巴巴拉分校神经科学研究所Gabe Luna提供。
同时检测一种以上抗原的抗体选择取决于至少两个重要标准：
Jackson：二级抗体的可用性不识别
彼此（来自相同的寄主物种），
分析系统中使用的其他初级抗体，
研究中的组织或细胞中存在内源性免疫球蛋白。
使用分辨率良好的探针（酶反应产物、荧光团或电子致密颗粒）。
多标签协议生成器
这个工具可以帮助你设计实验。它将应用上述标准来确定一级抗体之间的潜在交叉反应性，从而确定每个二级抗体所需的zui小交叉反应性。
输入样本的种类和您打算使用的抗体。优先对所有二级抗体使用相同的宿主物种，以zui小化交叉反应的可能性。抗原名称可以通过直接在表中编辑文本来定制。
请注意，即使工具有所指示，也可能无法获得每个潜在的zui小交叉反应性排列。山羊和驴子通常是J佳的二级抗体宿主物种选择，因为它们具有zui小的交叉反应性。
标记来自同一宿主物种的初级抗体
亲和纯化二级抗体的单价Fab片段可覆盖（阻断）免疫球蛋白的表面，用于同一宿主物种的双重标记一级抗体，或阻断组织切片或细胞表面的内源性免疫球蛋白。它们可以用于这些目的，因为Fab片段只有一个抗原结合位点（即它们是单价的）。
标记与样本来自同一物种的初级抗体
有时可能需要使用与样本来自同一物种的初级抗体，例如鼠对鼠。在这些情况下，二级抗体也可能检测到内源性免疫球蛋白，导致不必要的背景。这可以通过Fab片段阻断来避免。
进一步考虑
出于一般阻断目的，来自与二级抗体宿主相同物种的正常血清（5%v/v）为非特异性、保守序列和/或Fc受体结合提供了有效的背景降低。
二级抗体的单价Fab片段可以阻断抗体的特定不良反应。这种阻断适用于标本和初级抗体属于同一物种的情况（例如，小鼠贴上标签），或在同一宿主动物中产生多个初级抗体的情况。
可视化
成功的多重标记取决于探头的使用，探头的信号可以通过可用设备区分。
荧光显微镜是多重标记的通用平台，因为滤波器组被设计用于区分可用的多种荧光团。窄带通发射滤波器对于从多个荧光团中分离信号、抑制重叠光谱中的荧光检测至关重要。当计划多重标记协议时，用荧光团配制染料面板，其发射光谱分离良好，与可用仪器兼容。
联系客服
