ATG8(自噬相关蛋白8)参与自噬过程中细胞内成分的降解和再循环。ATG8是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中的分子自噬标记(Pérez-Pérez等人,2010,Plant Physiol.152:1874-88)。
中文名称:ATG8 |自噬相关蛋白
英文名字:ATG8 | Autophagy-related protein
规格:50ul
应用类型:Immunolocalization (IL), Western blot (WB)
免疫原:Fragment of recombinant ATG8 from Chlamydomonas reinhardtii, UniProt: A8JB85
来源宿主:兔
保存建议:在-20°C下冷冻干燥/复原储存;一旦复原,就进行等分,以避免重复的冻融循环。请记得在打开管子之前短暂旋转管子,以避免因材料粘附在管子的盖子或侧面而造成的任何损失。
对于拟南芥,与叶材料相比,使用ATG8抗体获得的信号在根的情况下更干净。为了获得最佳结果,请遵循Álvarez等人(2012)中描述的提取方案。ATG8信号对应于两条17kDa的带。
拟南芥细胞提取物的制备:
A、 植物首先受到自噬激活条件的影响:营养(氮或碳)限制或氧化以激活该降解过程。
B、 总蛋白提取物可按Álvarez的描述获得。叶片在液氮中研磨提取缓冲液体积(100mM Tris-HCl pH 8、400mM蔗糖、1mM EDTA、0.1mM苯甲基磺酰基氟化物(PMSF)、10 mg/ml脱氧胆酸钠、10µg/ml亮蛋白肽、10µg/ml蛋白抑制素A、4%(v/v)蛋白酶Roche的抑制剂鸡尾酒)。
C、 通过在4°C下以500 g离心10分钟去除细胞碎片。
重要说明:
建议使用更大的凝胶以获得更好的ATG8谱带分辨率。Midi protean凝胶更好而不是迷你凝胶。有9种ATG8亚型,这种抗体可能会识别所有这些亚型。
ATG8自噬蛋白应用实例:
图2:在15%SDS-PAGE上分离来自莱茵衣藻和拟南芥的15µg总蛋白使用半干法转移的硝化纤维素膜。在室温(RT)下,用5%的PBS干牛奶在搅拌下封闭印迹1小时。污渍在4ºC搅拌下,以1:1 000的稀释度在一级抗体中孵育过夜。倾析抗体溶液并进行印迹然后在室温搅拌下在TBS-T中洗涤一次15分钟和3次5分钟。在二级培养基中培养印迹抗体(抗兔IgG马萝卜过氧化物酶缀合物,AS09 602,来自Agrisera)在5%干牛奶中稀释至1:10 000,在RT下1小时煽动根据制造商的说明,如上所述洗涤印迹并用化学发光检测试剂显影5分钟说明书暴露时间为60秒。由西班牙IBVF的María Esther Pérez-Pérez博士和Ana M.Laureano Marín提供图1:根据Perez Perez等人的研究,用裂解缓冲液提取来自莱茵衣藻的30µg总蛋白,对照(C),自噬诱导(A)2010(植物生理学152:1874-1888)在15%SDS-PAGE上分离储罐转移。在室温(RT)下,用5%的牛奶在搅拌下封闭印迹1h。印迹在一级抗体中孵育在室温搅拌下,1:1000稀释1h。倾析抗体溶液并短暂冲洗印迹两次,然后洗涤一次15并在室温下在TBS-T中搅拌3次5分钟。印迹在二级抗体(抗兔IgG马萝卜过氧化物酶来自Agrisera AS09 602的缀合物,稀释至1:25 000)在RT下搅拌1小时。如上所述洗涤印迹,并用化学发光检测试剂。曝光时间为45秒。由西班牙IBVF的María Esther Pérez Perez博士提供
ATG8自噬蛋白相关文献参考:
Zharova et al. (2022) Role of Autophagy in Haematococcus lacustris Cell Growth under Salinity. Plants. 2022;
11(2):197.
Li et al. (2021) Chloroplast proteotoxic stress-induced autophagy is involved in the degradation of chloroplast proteins1/2 in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell Physiol. 2021 Feb 17:pcab029. doi: 10.1093/pcp/pcab029. Epub ahead of print. PMID: 33594417.
Li et al. (2021) The unfolded protein response plays dual roles in rice stripe virus infection through fine-tuning the movement protein accumulation. PLoS Pathog. 2021 Mar 4;17(3):e1009370. doi:10.1371/journal.ppat.1009370. Epubahead of print. PMID: 33662041.
Sun et al. (2021) Mechanistic insights into an atypical interaction between ATG8 and SH3P2 in Arabidopsis thaliana.
Autophagy. 2021 Oct 17:1-17. doi: 10.1080/15548627.2021.1976965. Epub ahead of print. PMID: 34657568.
Mishra et al. (2021) Interplay between abiotic (drought) and biotic (virus) stresses in tomato plants. Mol Plant Pathol.2021 Dec 30. doi: 10.1111/mpp.13172. Epub ahead of print. PMID: 34970822.
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