在过去数十年,用限制性内切酶产生黏性末端,在DNA连接酶的作用下,连接两个甚至更多片段的克隆方法,是载体构建的经典方案。但是现如今我们再提到克隆的时候,远远不再只有传统的限制酶克隆一种选择。其中Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA序列转移到载体上的克隆方法已经流行开来。不要觉得Gateway克隆技术高深莫测,其实了解一下你就能懂。
Gateway克隆方法是λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外形式。在体内,噬菌体(attP)和细菌(attB)的附着位点发生重组反应,噬菌体整合到细菌基因组中,两侧为两个新的重组位点(attL-left-和attR-right-)。在某些条件下,attL和attR位点可以重组,导致噬菌体从细菌染色体上切除并重新生成attP和attB位点。
即Gateway技术依赖于下面描述的两个反应:BP反应和LR反应,通过BP反应获得入门克隆(有时候我们也说中间克隆),再通过LR反应将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上,形成不同的表达载体。GeneCopoeia的 EZShuttle™重组克隆体系应用E.coli和λ噬菌体特异位点的重组酶促体系使 DNA片段在载体间相互转换,其原理与 Gateway克隆技术相同。
BP反应-构建入门载体:
通过PCR将attB位点添加到目的DAN序列两侧,形成attB-PCR产物。用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆。
EZRecombinase BP混合物,货号:RCBM-1002-020
LR反应-构建表达载体:
制作表达载体时,选择适合的目标载体非常重要。这种选择取决于许多因素,如宿主类型,所需的表达水平和实验目的。选定的attR表达载体与attL-入门载体重组以产生表达载体。
EZRecombinase LR混合液,货号:RCBM-1001-020
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