细胞外囊泡：心梗修复的新型“装备”

  作者：格兰芬多20级学硕 / 赖雨晖  

近十年来，有关细胞外囊泡(EVs)的生理、病理和治疗功能的研究文章和成果不断出现。

那么，细胞外囊泡是什么？

根据国际细胞外囊泡协会(ISEV)为细胞外囊泡制定的研究指南，细胞外囊泡是从细胞中自然释放的各种亚型膜结构（脂质双分子层分隔、不能复制即不包含功能性核)。

细胞外囊泡含有诸如蛋白质、基因、小RNA (miRNA)、病毒等生物活性分子，是天然的药物载体，可以治疗疾病或阻止疾病的恶化。

细胞外囊泡在损伤修复、治疗中可以有什么应用场景？   

例如，间充质干细胞来源细胞外小囊泡（small extracellular traps, sEVs）作为天然纳米载体，可携带多种小分子物质，用于糖尿病创面的治疗。

间充质干细胞所分泌sEVs中miR-17-5p可通过靶向TLR4/ROS/MAPK信号通路抑制NETs的形成，促进糖尿病创面愈合。

除此之外，内皮祖细胞（EPCs）的细胞外囊泡在修复治疗中的应用也十分广泛，近年来，在心肌修复领域，EPC治疗的相关研究十分火热。

作为内皮细胞的前体细胞，内皮祖细胞在心肌缺血后的血运重建中起着不可或缺的作用。

在血运重建中，内皮细胞和内皮祖细胞起什么样的作用？

心梗后心脏修复最重要的策略之一是促进心肌梗死边缘区的血管生成。

广义的血管新生(neovascularization)分为两种类型，一种见于发生初期，由内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)或者血管母细胞(angioblast)形成新的血管，叫做血管形成(vasculogenesis)；

另一种是由组织中既存的成熟血管的内皮细胞发生增殖和游走，形成小的血管，叫做血管新生(angiogenesis)。

而病理状态下的血管生成，既包括血管形成，也有血管新生。

EPC的细胞外囊泡在心肌梗死等缺血性损伤疾病治疗中显示出良好的潜力。然而，其临床应用仍然存在不少的关键限制点。

1

只有少数EPC能够真正到达心肌梗死区域

2

靶向递送的EPC难以在缺血、炎症、氧化应激等恶劣条件下存活，同时具有免疫排斥、致瘤性和输液毒性的风险

3

难以高效生产高活性的EPC细胞外囊泡

近期，来自南方医科大学的欧彩文教授和国科温州研究员常江研究员团队在Nature communications杂志上发表了题为”Extracellular vesicles engineering by silicates-activated endothelial progenitor cells for myocardial infarction treatment in male mice”的研究文章。这一研究为EPC治疗的困境提供了新的视角。

该研究利用来自生物活性陶瓷的硅酸盐离子来刺激内皮祖细胞，制备了大量具有高生物活性的细胞外囊泡，含有该细胞外囊泡的水凝胶微球可以显著促进血管生成，从而有效治疗雄性小鼠心肌梗死。

结果一 

为了确定硅酸盐离子溶液调节EPCs的最佳生物活性浓度，作者采用MTS法比较不同浓度硅酸盐离子溶液培养的EPCs的增殖情况。

结果显示，含硅酸盐离子的培养基在1/256到1/4的不同稀释度范围内均能显著增强EPCs的增殖，尤其是在1/256到1/64范围内。

qRT-PCR结果显示，与正常培养基相比，1/256、1/128和1/64稀释的硅酸盐离子溶液显著促进了EPCs中VEGFA、eNOS、SDF-1、IGF-1和HGF的表达，其中1/128稀释的刺激作用最强。

用1/128硅酸盐离子稀释刺激EPCs分泌EVs (CS-EPC-EVs)，透射电镜显示其具有典型的杯状囊泡结构，与常规培养条件下的EPC-EVs相似。纳米粒子跟踪分析(NTA)显示， CS-EPC-EVs的颗粒浓度明显高于EPC-EVs，表明硅酸盐离子提高了EPC培养中EV的产率。

此外，Western blot显示，CS-EPC-EVs和EPC-EVs均表达了EVs的特征蛋白，这进一步证明作者成功地从EPC培养的上清中分离到了所需的EVs。并且ELISA结果显示，关键血管生成因子(VEGFA、eNOS、HGF、IGF-1和SDF-1)在CS-EPC-EVs中的含量确实显著高于EPC-EVs。   

结果二

为了寻找CS-EPC-EVs对HUVECs的最佳干预浓度，作者评估了不同浓度CS-EPC-EVs对HUVECs增殖的影响。

结果表明，CS-EPC-EVs和EPC-EVs均能显著促进HUVECs的增殖，其中CS-EPC-EVs在50μg/mL时对HUVECs的增殖作用更为显著。此外，在50 ug/mL浓度下，用EVs(PKH -26标记，红色荧光)处理HUVECs(phalloidin标记，绿色荧光)12 h后，作者在共聚焦显微镜下观察到HUVECs的细胞骨架中有EVs，表明EVs的内吞作用。

在OGD条件下，伤口愈合和Transwell实验结果显示，CS-EPC-EVs和EPC-EVs均能增强OGD下HUVECs的迁移，且CS-EPC-EVs比EPC-EVs具有更好的迁移促进活性。   

此外， CS-EPC-EVs处理的HUVECs能够比EPC-EVs形成更多的管状网络，表明CS-EPC-EVs可以显著增强HUVECs的血管形成。TUNEL染色显示，CS-EPC-EVs对OGD处理后的HUVECs中具有比EPC-EVs更高的抗凋亡能力。    

最后，q-PCR和WB显示，与未处理的HUVECs相比，经CS-EPC-EVs和EPC-EVs干预后，HUVECs中5种血管生成基因(VEGFA、bFGF、IGF-1、eNOS和SDF-1)的表达水平均显著升高，且CS-EPC-EV的作用比EPC-EV更显著。

结果三

为了验证CS-EPC-EVs对心肌梗死的治疗效果，作者建立了急性心肌梗死(AMI)小鼠模型，并通过微流控技术制备了装载EV的GelMA-PEG微球，用于在梗死区域持续递送EVs。

对PKH26在上清液中的荧光强度分析显示，微球-EVs在前16天的释放速度更快，特别是在第2天，细胞外囊泡释放率为18.6%。16天后，其释放速度开始减缓。微球-EVs的荧光强度随着时间的推移而降低，但在第21天仍然可以看到微弱的红色荧光。   

结果四

第1天，PKH26红色荧光信号标记的EVs均匀分布在梗死区域，两组红色荧光量随时间的推移而减少，微球EV组荧光强度明显高于EV组。在第21天，EV组不再观察到荧光信号，而微球EV组仍然明显，表明制备的微球确实可以在注射部位有效地持续递送EVs。

超声心动图显示，与心肌梗死后第7天相比，EV组和EV-微球组的心功能在第14天明显改善。到心梗21天时，只有EV-微球组的心功能与第14天相比有显著改善，而纯EV组无显著差异。   

从左室射血分数(EF)、左室缩短分数(FS)的具体数值来看，微球+CS-EPC-EVs对小鼠心脏收缩功能的改善作用明显优于微球+ EPC-EVs，这表明CS-EPC-EVs比EPC-EVs具有更高的治疗效果。

WGA染色结果显示，微球+CS-EPC-EVs组心肌细胞的横截面积小于微球+EPC-EVs组，提示CS-EPC-EVs确实比EPC-EVs具有更高的生物活性，能够有效缓解梗死交界区心肌细胞的压力负荷。

第21天梗死边缘区域TUNEL染色结果显示，与PBS组相比，微球+EPC-EVs组和微球+CS-EPC-EVs组心肌梗死交界区TUNEL阳性细胞数量明显减少。前者抗凋亡活性明显高于后者。

结果五

SDF-1是造血干细胞和祖细胞在骨髓和循环血液之间迁移的关键因子，在调节内皮祖细胞的迁移和归巢中起重要作用。

作者推测CS-EPC-EVs可以增加心肌梗死区域内SDF-1的浓度，导致EPCs从血液循环中募集，增强EPCs向梗死区域的归巢。为了验证这一假设，作者在OGD条件下用不同的EVs处理HUVECs，并用条件培养基培养EPCs，通过Transwell实验观察条件培养基招募EPCs的能力。   

结果表明，不论在体内外，CS-EPC-EVs均能促进EPCs的迁移。

结果六

为了进一步探索CS-EPC-EVs治疗作用的潜在机制，作者通过高通量测序分析了EPC-EVs和CS-EPC-EVs的miRNA表达谱差异。   

为了验证测序结果，作者进一步通过q-PCR检测了5种miRNA在两组EV中的表达情况。结果显示，CS-EPC-EVs与EPC-EVs相比，这5个基因的表达均显著上调，尤其是miR-126a-3p的上调幅度最大。

与未经处理的EPCs相比，经过硅酸盐离子处理的EPCs中的miR-126a-3p显著升高，因此，硅酸盐离子能够上调miR-126a-3p在EPCs和EPCs来源的EVs中的表达。

结果七

为了验证EVs是否通过miR-126a-3p介导HUVECs血管生成，作者用miR-126a-3p抑制剂转染EPCs，然后用硅酸盐离子培养。随后，使用q-PCR验证miR-126a-3p在硅酸盐离子培养的EPCs (CS-EPCs)及其产生的EVs中的表达。

CS-126IEPC以及CS-126IEPC- EV中miR-126a-3p的表达明显低于对照组CS-NCIEPC。划痕愈合和Transwell实验显示，与CS-EPC-EV和CS-NCIEPC-EV相比，CS-126IEPC- EV不能促进HUVECs的迁移。这表明，CS-EPC-EV中的miR-126a-3p确实是其促进血管生成的主要生物活性分子。

为了进一步证实CS-EPC-EV中miR-126a-3p通过内皮细胞活化募集EPCs的作用，作者用CS-126IEPC- EV、CS-NCIEV - EV和CS-EPC- EV培养HUVECs，并分别使用CS-NCIEV+CM、CS-NCIEV+CM和CS-EV+CM条件培养基在Transwell实验中处理EPCs。

结果表明，与CS-EV+CM和CS-NCIEV+CM处理的EPCs相比，CS-126IEV+CM处理的EPCs的迁移率明显降低。

作者推测CS-EPC- EV可能抑制HUVECs中RGS16的表达，激活CXCR4受体促进miR-126a-3p的转移。

当miR-126a-3p被抑制后，与CS-EPC-EV组和CS-NCIEPC-EV组相比，CS-126IEPC-EV组RGS16蛋白水平显著升高，CXCR4、SDF-1和p-AKT蛋白水平显著降低。这些结果表明，在OGD条件下，CS-EPC- EV携带的miR-126a-3p通过激活HUVECs中的SDF-1/CXCR4轴及其下游PI3K/AKT/eNOS轴来刺激血管生成。

结果八

为了进一步研究硅酸盐离子对EPCs分选和分泌机制的影响，作者测量了硅酸盐离子培养48 h EPCs中5个常见分选基因的mRNA表达水平。   

硅酸盐离子培养的EPCs中hnRNPA2B1和nSMase2 (SMPD3) mRNA表达水平明显高于正常培养基培养的EPCs。

作者用特异性siRNA敲除了CS-EPCs中hnRNPA2B1和nSMase2 (SMPD3)的表达，显著降低了其衍生EV中的miR-126a-3p水平，而细胞中的miR-126a-3p水平几乎不变。

这一结果表明miR-126a3p是通过hnRNPA2B1和nSMase2(SMPD3)选择性加载到EV中的。           

这一研究表明，CS生物陶瓷来源的硅酸盐离子可以有效刺激内皮祖细胞等干细胞，从而分泌高产量、高生物活性的细胞外囊泡。通过水凝胶微球将高生物活性的细胞外囊泡传递到梗死部位，可以有效促进心肌梗死后心脏的恢复。

该研究为高生物活性细胞外囊泡治疗心肌梗死和其他缺血性损伤提供了一种新的策略。

组 长 点 评

郭玥

内科研究生第三党支部书记、副研究员、硕士研究生导师。

中山一院“柯麟新星” 、“柯麟菁英”人才。

入选2018博士后创新人才支持计划。

从事心血管疾病的临床与科研工作10年，研究方向：代谢性心血管疾病临床防治与机制研究。

主持国家自然科学基金、广东省自然科学基金、博士后创新人才支持基金、博士后面上基金等多个项目，发表SCI论著20余篇。

广东健康科普促进会-心血管病防治分会常委、广东省医师协会高血压专业医师分会第三届委员会委员、广东省精准应用学会心脏康复分会委员、广东省生理学会心血管专委会青年委员、广东省青年科学家协会会员、ACC FIT 、AHA/ESC professional member。

入选AHA/BCVS导师培育项目（全国仅4人）。

获颁美国心脏病学会荣誉证书。

点评：促进心肌梗死周边区新生血管生成，能提升心肌的存活率，改善梗死后心室重构和心脏功能，是治疗心肌梗死的重要策略之一。内皮祖细胞(EPCs)衍生的EV可携带miRNA、细胞因子、蛋白质等多种生物活性物质，通过旁分泌作用于梗死区内皮细胞，在调节血管再生中具有关键作用。因此，促进外泌体数量、质量以及增强组织保留率对于外泌体临床治疗具有重要意义。该研究发现硅酸盐离子溶液激活EPCs以诱导分泌大量的高活性EVs（CS-EPC-EV），并且通过水凝胶微球负载输送至心梗部位以促进心梗后心脏修复。机制上，在糖氧剥夺条件下，CS-EPC-EVs携带的miR-126a-3p通过激活ECs中SDF-1/CXCR4轴及其下游PI3K/AKT/eNOS轴以促进血管生成，为心梗治疗提供了新的思路。

参考文献

1.Therapeutic and diagnostic translation ofextracellular vesicles in cardiovascular diseases: Roadmap to the clinic. Circulation. 2021;143:1426-1449

2.Novel neutrophil extracellular trap-related mechanisms in diabetic wounds inspire a promising treatment strategy with hypoxia-challenged small extracellular vesicles, Bioact Mater.27:257-270..2023.04.007.

3.Extracellular vesicles engineering by silicates-activated endothelial progenitor cells for myocardial infarction treatment in male mice. Nat Commun. 2023 Apr 13;14(1):2094.     

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