免疫疗法已是全球抗肿瘤研究的热点。与传统的抗癌药物相比副作用小且晚期患者可能达到长期存活或临床治愈，PD-1/PD-L1免疫治疗备受瞩目。在临床治疗中，未经筛选的病例免疫治疗的疗效并不高，如何预测PD-1的效果？PD-L1的表达就是其中一个评价指标，表达水平在一定程度上提供治疗反应预期程度的信息，并帮助肿瘤医生评估受益风险比，从而为患者量身定制最佳治疗方案。PD-L1的准确评估对肿瘤患者的意义非同一般。
细胞程序性死亡受体(PD-1)是表达于细胞毒性T细胞及前B细胞的表面受体，其相应配体(PD-L1）表达于巨噬细胞、上皮细胞、其他正常细胞。正常情况下PD-1/PD-L1结合后保护正常细胞免受免疫识别、抑制细胞毒性T细胞对其破坏。如果这一过程异常则出现程序性死亡或凋亡。
质？核？
肿瘤免疫治疗就是利用这一原理，药物结合于相应靶点中的不同抗原表位阻止PD-1/PD-L1结合达到抗肿瘤的目的。PD-L1的生物学相关定位在癌细胞的质膜上，但也有表达在细胞质或细胞核中的现象，您是否也遇到过同样的问题？
一组来自Hara Polioudaki的实验数据表明，在改变前期处理条件后,乳腺癌MDA-MB-231细胞PD-L1膜蛋白定位发生了改变。详细信息见表1和图1：
乳腺癌细胞MDA-MB-231荧光标记PD-L1
第一步
第二步
第三步
缓冲液是否包含TritonX-100
PD-L1定位
图1a
4％甲醛，固定10分钟
标准条件下的免疫荧光
缓冲液中TritonX-100浓度0.2％
漫性细胞质染色，部分细胞呈现核染色
图1b
0.2％Triton X-100孵育2分
4％甲醛，固定10分钟
免疫荧光染色
缓冲液中不含TritonX-100
细胞核染色
图1c
温和的洗涤剂洋地黄皂苷100ng/ml孵育2分钟
4％甲醛固定10分钟
免疫荧光染色
缓冲液中不含TritonX-100
细胞膜染色
图1d
4％甲醛固定20分钟
标准条件下的免疫荧光
缓冲液中TritonX-100浓度0.2％
细胞质/膜染色
图1e
4％甲醛固定40分钟
标准条件下的免疫荧光
缓冲液中TritonX-100浓度0.2％
细胞质/膜染色
图1f
4％甲醛固定10分钟
0.2% Triton X-100孵育2分钟
免疫荧光染色
缓冲液中不含TritonX-100
细胞质/膜染色
表1. 标准条件下的免疫荧光(4% FA, 10分钟，所有缓冲液中Triton X-100 0.2%)
图1.乳腺癌细胞PD-L1膜蛋白定位在改变前期处理条件后发生了改变
实验表明，乳腺癌细胞的PD-L1免疫染色模式对去污剂有依赖性。在最佳实验细胞固定和孵育条件下（固定4％甲醛保持10-40分钟并用0.2％Triton-X溶解在缓冲液中没有进一步使用洗涤剂的情况下10分钟）PD-L1定位于质膜。
PD-L1的亚细胞定位（至少在乳腺癌中细胞）与固定/透化有关，导致PD-L1错误迁移到细胞质和/或核空间。延伸到其他应用于诊断性免疫组织化学指标，特别是当其定位与诊断和/或治疗决定相关时，蛋白正确的定位尤为重要。
参考文献：
Hara Polioudaki.et. Nuclear localization of PD-L1: artifact or reality? Cellular Oncology.2019
END
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