大家在FISH判读时，总会遇到一些影响判读的因素，比如视野内杂质较多，信号点不够亮或淬灭等等，今天小编给大家介绍其中两个常见问题：杂质与信号弱，也精选了实验中不好的结果作为案例，跟大家分析可能出现的原因及解决方案。大家在实验过程中还有其他的问题也可以踊跃在公众号留言，可能会被小编看到作为下期的主题哦。
01
不合适的洗涤
如果洗涤时间不足或溶液温度不够，则容易出现背景荧光。在洗片之前必须用温度计来测量溶液的温度。一次洗片不超过10片，如果有超过10片切片被洗涤，必须分次洗涤，在每次洗涤前再次升温并测量温度。
自然发生的背景
石蜡切片中一些明显的背景荧光可能会迷惑经验不足的观察者。首先要忽略粒细胞可能发出的明亮荧光，其次某些坚实的组织或杂质在各个荧光通道都会发出荧光。单个的荧光点比较麻烦，但可以通过切换不同荧光通道来辨别，它们通常在各个通道都会发光，不要总是以覆盖核信号为标准来定义这些点。背景信号有可能位于比正常FISH信号更高的平面上。
案例一：
黄色箭头指示绿色的背景荧光点。这些点可能比正常的荧光信号大，有更清晰的边缘。在各个荧光通道都发光且颜色更深。有很多背景斑点的区域应该尽量被避开进行观察。
案例二：
在该区域可见到高水平的绿色背景，应该避免检测这种区域。使用窄通道的，专为探针设计的滤光片可以有效降低这种背景。增加蛋白酶消化时间和更强烈的杂交后洗涤强度也可能有用。
案例三：
强烈的绿色自发荧光导致绿色信号和核边缘难以被检测。这种标本应该增加蛋白酶消化时间或适当延长煮片时间。
案例四：
该乳腺癌标本的红色杂点又大又多，看起来非常像HER2成簇扩增，实际上认真观察可以发现，这些红点大部分都不在细胞核内，而且信号亮度大小都和正常信号有着很大的区别。这种非常亮的自发荧光杂质不大容易通过延长洗涤时间或提高洗涤温度来去除，但是因为和信号点区别很大，且在各通道下都有强信号，可以在判读时自己区分。
02
不适当的组织固定和包埋
许多因素可能会导致组织固定不佳的问题。除了按照相关指南选择合适的福尔马林固定液、离体后及时固定外，还需注意一些特别的处理。比如周五开始固定的小穿刺样本容易固定过度，最好周末能安排值班，留待周一的话可能结果不佳。对于无法检测的标本，建议改变前处理的条件。需要注意，强酸或强碱脱钙处理后的样本（如骨肿瘤相关样本），往往会FISH检测没信号，目前我们还解决不了此问题。
不合适的DNA暴露
不合适的DNA暴露（用压力锅或化学试剂）是导致信号弱的重要因素。如果信号弱，建议增加压力锅或化学试剂处理的时间。
案例：安必平FISH说明书处理方式，结果信号偏弱。更改煮片方式为高压锅高压处理，信号增强。
DDIT3断裂探针
常规水煮，消化5分钟
高压锅水煮，消化5分钟
变性/杂交问题
变性或杂交的时间可以进行延长，以增加探针信号强度。
案例：安必平FISH说明书处理方式，结果信号偏弱。延长变性时间和提高变性温度，信号增强。
BCRABL(DF)融合探针
变性78度2分钟
变性85度5分钟
不合适的滤光片
滤光片对于信号的强弱具有重要作用，尽量避免非探针制造商指定的滤光片。滤光片的效果会随着使用时间延长而下降，因此也需要注意更换老化的滤光片。特别是注意不长使用的滤块（如青色），会长霉，导致不可逆破坏。
不合适的显微镜灯泡
汞灯在使用200-300小时后可能观察效果会偏弱，感觉影响观察时应被及时更换。
探针问题
是否过期、是否滴加探针量过少、按照探针保存要求来保存。
气泡
盖玻片下面的气泡会导致弱信号或无信号，可以在盖玻片盖上后用镊子轻压来减少气泡。如果气泡已经产生，可以轻轻按压盖玻片来将其移动到玻片边缘。气泡也可能因为切片表面不平整而产生，可以移动盖玻片到较平整的地方，或移去盖玻片并增加探针量。此外小部分不平的组织可以用镊子去掉。
弱FISH信号
由于组织固定、DNA暴露、蛋白酶消化等因素，FISH信号可能过弱而难以检测，可以通过延长煮片时间、延长蛋白酶消化时间和杂交时间来解决。
案例二样本:安必平FISH说明书处理方式，结果信号偏弱。延长消化时间，信号增强。
SYT断裂探针
水煮25分钟，消化4分钟
水煮25分钟，消化13分钟
大家在实验过程中还有其他的问题也可以踊跃在公众号留言，可能会被小编看到作为下期的主题哦。
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