研究背景:
外泌体荧光标记是外泌体功能研究中的必要的技术,然而在实际操作中对于使用多少的外泌体、加入多少的荧光染料、以及最终标记的效率是多少,这些问题都是不清楚的,给操作人员带来了不少困扰。
本研究目的是使用不同剂量的荧光染料标记外泌体,通过纳米流式仪检测外泌体荧光效率以及染色后外泌体重新纯化后的荧光效率。
材料与仪器:
1, 细胞株:293T (ATCC, CRL-3216)
2, 外泌体提取试剂盒(Umibio, UR52121)
3, 纳米流式检测仪 (NanoFCM, N30E)
4, 相关试剂:
外泌体专用无血清培养基 (Umibio,UR51102)
PKH67绿色荧光标记染料 (Umibio,UR52303)
实验方法:本文中 nM 实际为:μM
1, 细胞培养
293T细胞通过外泌体专用无血清培养基进行培养,收集细胞上清液,通过0.45 um滤器过滤处理。
2, 外泌体分离提取
通过Umibio细胞上清液外泌体提取试剂盒的说明书进行操作,提取的外泌体通过纳米流式检测仪进行颗粒浓度和BCA方法进行蛋白浓度测定。
3, 外泌体荧光染料标记
· 配制染料工作液:用Diluent C试剂(染色试剂盒自带)稀释染料储存液,配制浓度为100 nM的染料工作液(PKH67);
· 稀释染料工作液:按照2倍梯度通过Diluent C稀释100 nM的染料工作液;
· 向各实验组中加入10 uL对应浓度的染料,混匀后取10 uL进行纳米流式检测;
· 在标记的外泌体样品中补加入1 mL的PBS,使用试剂盒再次提取外泌体以去除游离染料;
· 沉淀用100 ul PBS重悬,再次进行纳米流式检测。
4, 外泌体荧光效率检测
实验结果:
1, 293T-Exosome检测:
Fig.1 外泌体电镜(A)和颗粒检测(B)
2, 外泌体荧光染料标记分组
3, 外泌体荧光标记效率检测
3.1染色后外泌体颗粒浓度变化趋势:
Fig.2 染色后颗粒浓度(Particle/mL)
3.2 染色后荧光外泌体比例:
100nM和50nM两个纯染料组中染料过量,荧光颗粒比例分别为81%和71.2%,其他各组的荧光外泌体比例均在35%以下。
Fig.3&4染色后荧光外泌体比例及趋势
3.3 重新提取后荧光外泌体比例:
Fig.5重提染色后荧光外泌体比例及趋势
实验结论:
根据本次实验,可以得到一些初步结论:
补充数据:
外泌体与细胞共孵育实验:
Fig.6 荧光外泌体共孵育检测
参考文献:
1, Wenhao Dai, et al. Exosomes-mediated synthetic dicer substrates delivery for intracellular dicer imaging detection. 2019, Biosensors and Bioelectronics
2, Zhe Liu, et al. Monophosphoryl lipid A alleviated radiation‐induced testicular injury through TLR4‐dependent exosomes. 2020, JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR MEDICINE
3, Shin-ichiro Ohno, et al. Systemically Injected Exosomes Targeted to EGFR Deliver Antitumor MicroRNA to Breast Cancer Cells. 2012, The American Society of Gene & Cell Therapy
4, Hui Zhao, et al. Exosomes From Adipose-Derived Stem Cells Attenuate Adipose Inflammation and Obesity Through Polarizing M2 Macrophages and Beiging in White Adipose Tissue.2018,Diabetes
5, Ye Tian, et al. Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry. 2018, ACS Nano
6, Peng Lv, et al. Genetically Engineered Cell Membrane Nanovesicles for Oncolytic Adenovirus Delivery: A Versatile Platform for Cancer Virotherapy. 2019, Nano Letters
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