钩端螺旋体IgM检测试剂盒（酶联免疫法）说明书

作 者：江彬

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【产品名称】

通用名称：钩端螺旋体IgM检测试剂盒（酶联免疫法）

英文名称：Leptospira IgM ELISA Kit

【产品规格】

96T

【预期用途】

试剂盒用于定性检测血清和血浆中钩端螺旋体IgM抗体

【前言简介】

钩端螺旋体的临床症状表现从轻微伤寒到肝肾严重受损的黄疸病。钩体存在于啮齿类动物和大部分的家畜身上，在肾小管内寄生，然后从尿液中排出。人类感染来源于直接接触已感染的动物（如兽医，屠宰场工人或乳制品工人）或是被动物携带者污染的空气（如农业员），已证明有潜在感染风险的动物接触到的水用来洗澡或是游泳也会传染。钩体通过破损的皮肤，黏膜表面或是眼睛进入宿主细胞，潜伏期在3-30天不等，但通常在10-12天时就会发现，在发病的第6天到第10天间就可检测到抗体，3-4周内达到高峰期，之后抗体水平会慢慢减少，但数年后仍可检测到抗体

流行病学因素，临床症状，暴露于流行病地区和其他的实验室结果都可视为急性疾病，急性疾病的诊断也可包括多数情况下阳性试验的确诊，此试验可诊断钩端螺旋体的急性感染，阳性样本需通过其他方法进一步确诊

【检测原理】

微孔板已包被经纯化的钩端螺旋体抗原，第一次温育，样品血清中的抗体与微孔板上的抗原进行结合，洗去未结合的样品，加酶联物，与结合在孔内的抗体结合，第二次洗涤后，加TMB底物液，颜色变蓝，加终止液，由蓝色变为黄色，结果可直接读取或是酶标仪检测

【试剂盒组成成分】

微孔板             12×8

包被了纯化的钩端螺旋体抗原

酶联物             1×11ml

含HRP标记的抗人IgM

阳性质控           1×1ml

阴性质控           1×1ml

底物液             1×11ml

含TMB

RF吸附剂          1×5ml

含羊抗人IgG

洗涤液             1×25ml

20倍浓缩

稀释缓冲液         2×30ml

终止液             1×11ml

含0.73M的磷酸

所需材料（未提供）

1.       移液枪

2.       洗涤瓶

3.       去离子水和量筒

4.       稀释管

5.       吸水纸

6.       酶标仪

【样本要求】

本实验采用血清样本，血清在2-8℃下可保存5天，-20℃可保存3~6个月，全血样本不建议冻存。

【检测方法】

实验前将所有试剂和样本平衡至室温

试验操作中，避免孔内形成气泡，气泡会影响整个实验和最终结果读数，洗板后将残留液在吸水纸上拍干

阴性和阳性质控已稀释，无需进一步稀释

不要对阴性和阳性质控中加RF吸附剂。

检测步骤

1.       将实验所需的板条固定于板架上（两个质控品加上样品）

2.       样品血清用稀释缓冲液以1:40比例进行稀释（10µl血清+390µl的稀释缓冲液）

3.       准备所需数量的样本稀释管。在相应的管中加入100µl已稀释样本。并于每个有样本的微孔中加入40µl RE吸附剂，混匀，室温温育5-10min。此步骤不能在微孔中进行。

4.       室温下温育5min，然后在1#孔和2#孔内分别加入100µl的阴性和阳性质控，吸取100µl的试验样品至剩下的孔内。

5.       室温下温育10min，然后洗涤，最后一次洗涤后，吸水纸上拍干

6.       每孔加入100µl酶联物

7.       室温下温育10min，然后洗涤，最后一次洗涤后，吸水纸上拍干

8.       每孔加入100µl TMB底物液

9.       室温下温育5min

10.   每孔加入100µl终止液，轻轻晃动微孔板混匀15秒

11.   加入终止液1h内读数

每次洗板步骤均加满洗涤液洗涤3次，避免气泡的形成，以免影响实验结果。

【结果计算】

目测：将微孔板置于白色纸上，是背景成为白色，用“+、++、+++”标记

酶标仪读数：对空气读数调零。设置波长为450nm/620-650nm

无反应：OD值在0.0-0.15之间时视为无反应，表明样本中不含有此抗体，因为在病情早期可能不存在抗体，2-3周后再重新诊断确认，后期病人会显现出微弱反应；

弱反应：+或++，弱反应样本应慎重处理；正常情况下弱反应样本不多见，但也有可能，

有反应：样本OD值＞1.0或+++，则表明有特异性抗体存在，单一的抗体存在不能用于急性感染的诊断，因为抗体从暴露起可能已经循环了很长一段时间了

质量控制

通过使用质控品来确定试剂盒是否稳定。如果质控品的OD超过所允许的范围，则试剂盒不能使用。

质控品的允许范围：

阴性质控：0.0~0.20 OD

阳性质控：大于等于0.5 OD

【注意事项】

1. 按说明书要求严格操作，样本稀释，温育时间/温度和洗涤都是最优化的条件，若操作不严谨则会影响实验的灵敏度和特异性

2. 仅供体外诊断使用

3. 不要交换不同批次的试剂盒成分

4. 不要使用过期的试剂，有效期见各试剂标签，使用过期试剂会影响实验结果

5. 不用的微孔板应贮存于含有干燥剂的密封袋内，避免潮湿

6. 不要使用出现沉淀或浑浊的试剂

   除洗涤浓缩液外：洗涤浓缩液在冰箱贮存中会出现沉淀，只要温度升高就会溶解

7. 样本或试剂中都不要加叠氮化物

8. 质控和部分试剂还有硫柳汞防腐剂，它会刺激皮肤、眼睛和粘膜，避免接触，万一接触到了则立即用大量水冲洗

9. 不要使用可以支持微生物生长或由于高脂质而引起浑浊的血清样本，高脂质血清样本在使用前应进行处理使其变澄清

10. 视所有试剂和样本为潜在感染的物质，阴性质控已检测到HBV,HIV样本呈阴性，所有样本都应小心处理，防止气溶胶和样本溅出

11. 5%的磷酸水溶液若接触到皮肤或眼睛则应用大量水冲洗

12. 色盲或视觉有问题的则不能目测试验结果，可使用酶标仪进行结果读数